T∕CACM 012-2016 金钱白花蛇快速 PCR 鉴定

ICS:11.120.99C10/29团体标T/CACM0122016金钱白花蛇快速PCR鉴定QulicklypcRidentificationofBulngarulsparvuls2016-12-12发布2016-12-12实施中华中医药学会发布前言 2规范性引用文件 3术语和定义 5仪器设备 6试剂和溶液配制 7检验程序 8结果判定 9结果报告 附录A(资料性附录)金钱白花蛇快速PCR鉴定体系的建立 本标准的全部技术内容为推荐性。本标准是对《中华人民共和国药典》标准的补充。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位:中国中医科学院中药资源中心、广东省食品药品检验所。本标准主要起草人:袁媛、黄璐琦、李华、蒋超、杨志业、赵玉洋、何雅莉。请注意本标准的某些内容有可能涉及专利,本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。1金钱白花蛇快速PCR鉴定本标准规定了使用快速PCR鉴定金钱白花蛇药材和饮片的通用方法和要求。本标准适用于金钱白花蛇药材和饮片鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。《中华人民共和国药典》(2015年版)GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》GB/T23632《进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程》GB/T27403《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。按一定规则取自某一整体的一个或多个部分,并能反映该整体的相关信息,可以作为判断该整体的基础。从样品提取出DNA的方法。通过一定技术使一段特定的DNA片段拷贝数增加的过程,可通过聚合酶链式反应技术实现。聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)模板DNA先经高温变性为单链,两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火,在DNA聚合酶的作用下,以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使退火引物得以延伸,然后不断重复变性、退火和延伸这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段拷贝数呈几何倍数扩增。其扩增产物可通过多种特异性和敏感性好的方法进行分析。一般使用对照药材代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用于证明鉴定过程可获得目标核酸片段的操作。使用常见伪品药材代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程。以水代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用以证明提取过程中没有核酸2污染。金钱白花蛇快速PCR鉴定应采用抽取有代表性的送检样品与对照药材比较的验证方式,即依据金钱白花蛇特异性DNA序列进行鉴定。利用碱裂解法提取金钱白花蛇模板DNA,以提取的DNA为模板进行PCR扩增,荧光检测或琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。5仪器设备所有制备样品使用的器具在使用前应灭菌处理。使用前应进行温度校准。5.1.2手持式紫外灯5.1.3连续可调微量移液枪5.1.4保温设备6试剂和溶液配制除另有规定外,实验试剂为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂;实验用水符合GB/T6682的要求;所配制的试剂均应灭菌后保存,并在容器上注明试剂名称、浓度、配制时间、保存条件、失效日期和配制者姓名;PCR试剂应小量分装保存以减少污染;材料及试剂的保存都应有防污染措施。含有0.5mol/L氢氧化钠(NaOH)、1%聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40)、1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX100)溶液:在800mL去离子水中溶解26.2中和缓冲液含有0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)溶液,pH值为8.0:在800mL去离子水中溶解12.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris),冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分装后高压灭菌。6.3dNTP混合液6.520%PVP溶液在80mL去离子水中溶解20.0gPVP-40,加水定容至100mL,分装后过滤除菌,冷却后-20益保存。在80mL去离子水中溶解1.0g牛血清白蛋白(BSA),加水定容至100mL,分装后过滤除菌,冷却后-20益保存。时置冰上操作。36.8金钱白花蛇检测用引物对序列2EDTA·2H2O,加入醋酸,充分混匀,加去离子水定容至1L,室温保存,使用时用去离子水50倍稀释。在80mL去离子水中溶解溴酚蓝250mg,二甲苯青250mg,蔗糖250mg,加水定容至100mL,分装。7检验程序为防止交叉污染,收样、取样、粉碎、DNA提取、核酸扩增和产物检测应在不同操作间或在同一操作间不同隔离区域进行,进入各区域应严格按照单一方向进行,即样品制备区寅核酸制备区寅扩增区寅检测区。送检样品抽样方法参照2015年版《中华人民共和国药典》四部药材和饮片取样法(通则0211)进行取样。送检样品应可分成2批,每批可分为同样的3份,总量不应少于20g。收样时应检查包装的完整性,并在样品袋上贴上标签,填写采集数据表。对商品包装和送样说明进行拍照记录,照片随样品一起备档。去除药材和饮片表面附着物,依次使用75%乙醇和无菌双蒸水擦拭表面后晾干。取送检样品置乳钵、匀浆机或球磨粉碎仪中充分研磨粉碎,必要时加适量液氮研磨。800滋L中和缓冲液,充分混匀;12000r/min离心1min800滋L中和缓冲液,充分混匀;12000r/min离心1min或静置5min;转移500滋L上清液至一新的EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(1),作)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(5mL离),为DNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(心管),模板)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(加入5),待测或)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(滋),0)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(L),益)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(中),保)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(和),存)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(缓),备)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(冲),用)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(充),个)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(分),送)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(混),检)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(匀),样)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(1),品)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(2000r/),必须重)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(离心),次)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(1m),每)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(n或静置5m),1次从送检样)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(转),提)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(移),取)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(上),核)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(清),酸)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(液),的)过程都必须设置1个提取空白对照。注:使用碱裂解法提取的金钱白花蛇DNA可在4益下保存3天或-20益下保存7天,不宜长期保存。7.4核酸扩增首次使用本方法时,应校对PCR仪温控准确性,并使用阳性对照和阴性对照以核对使用的Taq聚合酶的适用性。7.4.1对照试验PCR检测应重复2次,并设置阳性对照、阴性对照和空白对照。7.4.2PCR反应体系EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(在),液)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(0滋L),10m)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(PC),L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(管中),1滋L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(反应),引物)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(体),0滋)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(2),L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(L),各)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(应),滋L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(系),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(包括10伊PCR),qDNA聚合酶)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(缓),1滋)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(冲),L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(2),模)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(5滋L),板D)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(T),1)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(P),0)7.4.3PCR反应参数延伸10s,30个循环。对扩增产物进行检测或置4益下保存。47.5扩增产物检测7.5.1荧光染料显色检测长下检测荧光,若PCR产物出现与阳性对照相同的荧光即为阳性结果,反之为阴性结果。7.5.2琼脂糖凝胶电泳检测取PCR扩增产物,加入6伊上样缓冲液混匀,2%琼脂糖凝胶电泳染色,紫外波长下检测。阴性对照和空白对照无条带,且送检样品与阳性对照在500~750bp范围内有一条DNA条带为阳性结果,否则为阴性结果。8结果判定在阴性对照、阳性对照和空白对照结果符合规定的情况下,若送检样品与阳性对照一致,则判定测试结果为阳性,否则为阴性。9结果报告9.2鉴定报告样品经检测后,实验室应根据实验的具体操作程序和结果做好详细的实验记录,出具检测报告。检测报告至少包含以下内容:送检样品的名称、状态和明确的标识;检测依据;取样方法与日期;储存条件;检测开始和结束日期;检测负责人和实验人员;阳性对照、阴性对照、送检样品;特定方法取得的结果,结果使用的单位及计算方法;检测结论;检测过程观察到的特别情况;其他需要报告的内容。检测结果应来自同一实验室样品的两份送检样品。当一份送检样品的结果为阳性,另一份为阴性时,要重新测试。可以适当增加核酸扩增反应体系中DNA模板量,使两份样品得到相同结果。每个样品应至少制备两份DNA,必要时需检测模板DNA的质量,确保提取的DNA片段大于扩增片段。核酸扩增可设置PCR抑制剂对照。如果经过两次以上从核酸提取开始的重复检测,检测结果不一致,可在检测报告中注明检测低限,检测低限应符合最低含量水平。11废弃物处理检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理,有毒有害废弃物应经过除害再进行处理,处理要符合环保要求。5附录A(资料性附录)金钱白花蛇快速PCR鉴定体系的建立A.1金钱白花蛇及其伪品资料金钱白花蛇为2015年版《中国药典》的收录品种,来源于眼镜蛇科环蛇属动物银环蛇BungarusmulticinctusBlyth的幼蛇干燥体。目前药材市场上金钱白花蛇伪品数目很多,质量问题严重,其伪品共分为3大类:淤形态类似的其他种属幼蛇,包括赤链蛇、赤链华游蛇、中国水蛇、铅色水蛇、金环蛇、黄链蛇、黑背白环蛇等;于拼接蛇,系指使用金钱白花蛇头,拼接其他伪品蛇的蛇身制成成品,主要有铅色水蛇画上横纹拼接金钱白花蛇身,或赤链蛇、赤链华游蛇染色后接上金钱白花蛇头制成的伪品;盂把大条的银环蛇切开,加工成小蛇形态,接上金钱白花蛇头制成的伪品。对亳州、安国、玉林、广州、昆明等几个大型药材市场进行走访调查发现,在市场上见到的金钱白花蛇伪品总共有6种,分别为铅色水蛇、中国水蛇、赤链蛇、赤链华游蛇、金环蛇、眼镜蛇,其中最为常见的是赤链蛇和赤链华游蛇。A.2引物设计使用BioEdit软件对正品金钱白花蛇以及黑眉锦蛇、红点锦蛇、滑鼠蛇、赤链华游蛇、赤链蛇等伪品的Cytb序列进行序列比较图A.1金钱白花蛇正伪品序列比对及引物设计结果6A.3实验样品采集不同药材市场与13家不同药房金钱白花蛇样品进行方法的适用性检测;采集各大药材市场中存在的24种其他科属蛇类样品进行特异性检测,见表A.1。表A.1蛇类样品表物种拉丁名采集地个数1乌梢蛇安徽亳州82乌梢蛇北京同仁堂13乌梢蛇中药资源中心14乌梢蛇北京永安堂15金钱白花蛇安徽亳州6金钱白花蛇深圳市药品检验所27金钱白花蛇河北安国17金钱白花蛇各大药房7蕲蛇安徽亳州48蕲蛇安徽黄山19蕲蛇北京同仁堂1蕲蛇北京永安堂1蕲蛇中药资源中心1眼镜蛇安徽亳州3孟加拉眼镜蛇安徽亳州1中国水蛇安徽亳州2铅色水蛇安徽亳州1铅色水蛇河北安国1赤链蛇安徽亳州3竹叶青安徽亳州1王锦蛇安徽亳州3王锦蛇深圳市药品检验所1王锦蛇中国食品药品检定研究院1红纹滞卵蛇安徽亳州1红纹滞卵蛇中国食品药品检定研究院1灰鼠蛇安徽亳州2短尾蝮蛇安徽亳州1蝮蛇安徽亳州1黑眉锦蛇深圳市药品检验所1黑眉锦蛇江西昌北1平颏海蛇安徽亳州2三索锦蛇河北安国1百花锦蛇中国食品药品检定研究院1赤链华游蛇中国食品药品检定研究院1虎斑游蛇中国食品药品检定研究院1虎斑游蛇河北安国1山烙铁头蛇中国食品药品检定研究院17A.4PCR反应体系的建立模板/对照DNA(10~50ng)1滋L,用无菌双蒸水补足反应体积至25滋L。将反应液振荡心。将PCR管置PCR仪内进行PCR反应。PCR反应程序:94益预变性1min;94益变性10s,62益退火延伸10s,30个循环,获得扩增产物。取出PCR管,对反应产物进行检测或置4益下保存。取5滋L反应液经1.5%琼脂糖凝胶电泳,染色后接通电源按5V/cm恒压进行电泳20min,电泳结束后,将凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。上述PCR各主要参数均经过系统的考察。A.4.1碱裂解法提取蛇类材料总DNA使用碱裂解法提取蛇类样品总DNA,使用通用引物Cytb-H/Cytb-L进行扩增,以检测所获得蛇类样品总DNA是否适用于PCR扩增。经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,利用Cytb-H/Cytb-L引物,所有样品均获得约400bp大小的扩增产物,见图A.2,说明碱裂解法提取的DNA可以满足PCR反应的要求。M1M1234567891011121314151617181920212223C图A.2Cytb-H/Cytb-L通用引物扩增结果M:DL2000marker;1:乌梢蛇;2:金钱白花蛇;3:蕲蛇;4:眼镜蛇;5:孟加拉眼镜蛇;6:中国水蛇;7:铅色水蛇;8:铅色水蛇;9:赤链蛇;10:竹叶青;11:王锦蛇;12:王锦蛇;13:王锦蛇;14:红纹滞卵蛇;15:灰鼠蛇;16:蝮蛇;17:黑眉锦蛇;18:平颏海蛇;19:三索锦蛇;20:百花锦蛇;21:赤链华游蛇;22:虎斑游蛇;23:山烙铁头蛇;C:阴性对照A.4.2金钱白花蛇分子鉴定条件考察使用设计的金钱白花蛇快速PCR鉴定引物对不同产地金钱白花蛇及其混伪品进行扩增,并考察:淤退火温度:58益,60益,62益,64益;于PCR循环数:30,28,26,24,22个循环;盂变性温度:司),TC-512型PCR扩增仪(TECHNE公司)。对金钱白花蛇鉴定结果进行考察,结果表明,PCR反应程序中,94益预变性1min后,满足变性温度超过88益,变性时间超过5s,退火温度在58~64益之间,退火时间超过5s,循环数超过28个循环参数均可准确鉴定金钱白花蛇,见图A.3。为增加金钱白花蛇鉴定的稳定性,标准制定参数均在此基础上有所提高。最终确定金钱白花蛇快速PCR鉴定的反应程序为:94益预变性1min;A.4.3方法的适用性与特异性考察采用上述确定的程序,对金钱白花蛇13批样品及20批伪品进行鉴定(图A.4、图A.5),结果表明该体系能稳定准确地鉴定金钱白花蛇。8退火温度退火温度变性温度58℃60℃62℃64℃M12121212变性时间20SM1212121212循环次数PCR仪Tsq酶30C28C26C24CM121212121212121212121292℃90℃88℃86℃abCdABC退火时间20S10S10S5S5S3S3Slsls图A.3金钱白花蛇快速PCR反应的优化1:金钱白花蛇;2:眼镜蛇。A:VeritiPCR扩增仪(AppliedBiosystems公司);B:9700型PCR扩增仪(ABI公司);C:TC-512型PCR扩增仪(TECHNE公司)。a:rTaq(Takara公司)MM12345678910111213141516图A.