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35DB35/T2024—2021鳗鲡疱疹病毒感染诊断技术规范ProtocolofdiagnosistechnologyforHerpesvirusanguillaeinfection2021-11-23发布2022-02-23实施福建省市场监督管理局发布I 4 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草1GB/T6682分析实验室用水规CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrithyDNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribondNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribEDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetePCR：聚合酶链式反应（PolymerasTaq酶：DNA聚合酶（ThermusAquatiTBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（TTris：三羟甲基氨基甲烷（Trishydroxym25.3dNTP：dCTP、dGTP、dATP、在鳗鲡的鳃、肝脏、脾脏、肾脏等部位及体表黏液，共取50mg～100mg样品，置于1.5mL离心管后加入1.5倍体积的异丙醇，混匀后，静置5min，12000g离心10min，弃上清液；加入600μL75%3乙醇，混匀后12000g离心10min，弃上清液，室温静置5在0.2mL离心管中加入10×PCR缓冲液（见附录A的A.7）2.5μL、25mmol/L氯化镁（MgCl2见附录A的A.6）1μL、dNTP2μL、上下游引物各0.5μL、Taq酶2U、1μL待测样品DNA为模板，补充水反应液混匀后，离心使其集中在离心管底部，将离心管置于PCR扩增仪，按照94℃4min；再用TBE电泳缓冲液（见附录A的A.4）配制1%的琼脂糖[含0.5μg/mLEB（见附录A的A平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。取6μLPCR扩增产物和2μL电泳上样缓冲液（见附录A的A.8）混匀，加入样品孔，5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝4按2%CTAB，1.4mmol/LNaCl，20mmol/LEDTA，20mmol/LTris-HClpH7.5配制。使A.4.1成分A.4.2制法A.7.1成分5A.7.2制法每100mL溶液中含溴酚蓝0.256CATGCCGGGAGTCTTTTTGATCACGTCCTCCACTATAAGGATCTTTTGTCGCCCCGAGAGCGTGGTCAACATCTCCGATACGCCGTAGTGCGAGTTGGCGCAGATCTTCATCTCGTTCTGCAGCTGGTTGAAGTATTTTTTCAGTCCGGCTTCATGTCGCCCTTGTATTTGTTTCGCATGCTCAGGTAGTGGCGGAGGCTGGAAGACGTGTACGTCGTAAACCTGCCACACTCTTGTGTAGGAGGATGGTGTAGAG

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