《动物实验技术》课件-专家讲座：玩转“基因”的实验动物

动物实验技术“玩转”基因的实验动物基因工程-基因编辑技术自1972年保罗·伯格构建了世界上第一个重组DNA分子,自此掀起了基因工程研究的热潮。半个世纪以来，基因工程技术已获得了突飞猛进的发展,取得了许多世人瞩目的成就，对农业生产、医疗卫生、轻工食品和环境卫生等诸多领域产生了巨大影响，成为生物学研究的最前沿学科。目前以基因工程技术为主体的生物技术将成为21世纪主导技术之一。基因工程-基因编辑技术美国斯坦福大学的生物化学、荣誉教授保罗·伯格1980年诺贝尔化学奖基因工程技术为主体的生物技术已成为21世纪主导技术之一专业基础课程专业核心课程动物实验技术技术医学分子生物学技术CRISPER/Cas9在动物疾病模型构建中的应用一、基因编辑技术对目标基因及其转录产物进行编辑（定向改造），实现特定DNA片段的加入、删除，特定DNA碱基的缺失、替换等，以改变目的基因或调控元件的序列、表达量或功能。·基因编辑的原理基本原理是通过序列特异性的DNA结合结构域和非特异性的DNA修饰结构域组合而成的序列特异性核酸内切酶，识别染色体上的DNA靶位点，进行切割并产生DNA双链断裂，诱导DNA的损伤修复，从而实现对指定基因组的定向编辑。基因“魔剪”——CRISPER/Cas9“这项基因工具蕴含着强大的力量，影响着我们所有人。它不仅彻底改变了基础科学，而且推动了创新作物的诞生，未来还将会为突破性的新医学疗法指明方向”

——诺贝尔化学委员会主席

ClaesGustafsson二、认识CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球。操作简单花费少耗时短基因功能研究遗传疾病治疗构建动物模型培育家畜新品种基因“魔剪”——CRISPER/Cas9什么是CRISPER/Cas9？CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）是一系列重复的DNA序列，它们之间由独特的间隔序列分隔。这些间隔序列是细菌在以前遭受病毒侵袭时获得的病毒DNA片段。CRISPR-Cas9系统最初是在细菌中发现的一种免疫机制，用于抵御外来的病毒和质粒。Cas9（CRISPR-associatedprotein9）是一种核酸酶，能够在特定的DNA序列上切割双链DNA。基因“魔剪”——CRISPER/Cas9CRISPER/Cas9系统的组成其中，crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组成gRNA(guideRNA)，gRNA与Cas9蛋白结合后引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA序列。Cas9核酸酶crRNAtracrRNA为了方便实验设计以及提高gRNA的稳定性，JenniferDoudna和EmmanuelleCharpentier将crRNA和tracrRNA融合成一条RNA，并把其称为sgRNA(single-guideRNA)。基因“魔剪”——CRISPER/Cas9在基因编辑中，研究人员设计了一个与目标DNA序列互补的单链RNA引导分子（sgRNA），将其与Cas9蛋白复合体一起导入目标细胞。sgRNA引导Cas9定位到目标DNA序列，并促使Cas9在该位置切割DNA双链。细胞修复切割产生的DNA断裂时，可以引入突变，从而实现基因的敲除、插入或替换。基因“魔剪”——CRISPER/Cas9基因编辑的原理在基因编辑中，研究人员设计了一个与目标DNA序列互补的单链RNA引导分子（sgRNA），将其与Cas9蛋白复合体一起导入目标细胞。sgRNA引导Cas9定位到目标DNA序列，并促使Cas9在该位置切割DNA双链。细胞修复切割产生的DNA断裂时，可以引入突变，从而实现基因的敲除、插入或替换。新技术应用推动了对于人类疾病的认知CRISPR-Cas9应用方式(2）基因敲入（Knock-in）当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行同源重组修复（HDR），从而实现基因敲入。(3）基因抑制、基因激活（RepressionorActivation）（4）多重编辑（MultiplexEditing）将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。（1）基因敲除（Knock-out）Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂（5）功能基因组筛选利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。新技术应用推动了对于人类疾病的认知CRISPR-Cas9应用方式基础研究：用于研究基因功能、基因表达调控、遗传疾病机制等。01医学应用：用于治疗遗传性疾病、癌症、传染病等，通过修复或改变致病基因来治疗疾病。02农业应用：用于培育抗病虫害、高产量或特定性状的作物。03生物技术：用于微生物工程、合成生物学等领域，开发新的生物制品和生产过程。04CRISPR-Cas9技术的应用动物疾病模型可以模拟人类疾病的生物学和病理特征，在疾病发生机理和药物筛选等基础和转化研究中发挥关键作用。

编辑效率高

操作简单

适用范围广神经退行性疾病肿瘤白化病神经退行性疾病相关基因编辑动物模型YanS,TuZ,LiuZ,FanN,YangH,YangS,YangW,ZhaoY,OuyangZ,LaiC,YangH,LiL,LiuQ,ShiH,XuG,ZhaoH,WeiH,PeiZ,LiS,LaiL,LiXJ.AHuntingtinKnockinPigModelRecapitulatesFeaturesofSelectiveNeurodegenerationinHuntington'sDisease.Cell.2018May3;173(4):989-1002.e13.doi:10.1016/j.cell.2018.03.005.Epub2018Mar29.PMID:29606351;PMCID:PMC5935586.亨廷顿病(Huntington’sdisease，HD)是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，由编码亨廷顿蛋白(Huntingtin，HTT)的基因突变引起。神经退行性疾病相关基因编辑动物模型ZhouXQ,XinJG,FanNN,etal.GenerationofCRISPR/Cas9-mediatedgene-targetedpigsviasomaticcellnucleartransfer.CellMolLifeSci,2015,72(6):1175–1184.帕金森症(Parkinson’sdisease，PD)是一种常见的运动性疾病，常发于中老年期，其病理特征是黑质纹状体通路中多巴胺能神经元的变性缺失，从而引起肌肉僵硬、运动迟缓和静止性震颤等症状。癌症基因编辑动物模型NgSR,RideoutIIIWM,Akama-GarrenEH,etal.CRISPR-mediatedmodelingandfunctionalvalidationofcandidatetumorsuppressorgenesinsmallcelllungcancer.ProcNatlAcadSciUSA,2020,117(1):513-521.小细胞肺癌(Smallcelllungcancer，SCLC)是一种高度侵袭性的神经内分泌肺癌，约占所有肺癌病例的13%–15%。SCLC生长速度快、易发生复发和转移。癌症基因编辑动物模型XueW,ChenSD,YinH,etal.CRISPR-mediateddirectmutationofcancergenesinthemouseliver.Nature,2014,514(7522):380-384肝癌是指发生于肝脏细胞的恶性肿瘤，分为原发性肝癌和继发性肝癌。手术切除和放化疗仍是临床治疗的主要手段，但易造成复发和转移，使得肝癌患者预后很差，5年生存率仅为14.1%。神经退行性疾病相关基因编辑动物模型亨廷顿病(Huntington’sdisease，HD)是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，由编码亨廷顿蛋白(Huntingtin，HTT)的基因突变引起。YanS,TuZ,LiuZ,FanN,YangH,YangS,YangW,ZhaoY,OuyangZ,LaiC,YangH,LiL,LiuQ,ShiH,XuG,ZhaoH,WeiH,PeiZ,LiS,LaiL,LiXJ.AHuntingtinKnockinPigModelRecapitulatesFeaturesofSelectiveNeurodegenerationinHuntington'sDisease.Cell.2018May3;173(4):989-1002.e13.doi:10.1016/j.cell.2018.03.005.Epub2018Mar29.PMID:29606351;PMCID:PMC5935586.神经退行性疾病相关基因编辑动物模型帕金森症(Parkinson’sdisease，PD)是一种常见的运动性疾病，常发于中老年期，其病理特征是黑质纹状体通路中多巴胺能神经元的变性缺失，从而引起肌肉僵硬、运动迟缓和静止性震颤等症状。ZhouXQ,XinJG,FanNN,etal.GenerationofCRISPR/Cas9-mediatedgene-targetedpigsviasomaticcellnucleartransfer.CellMolLifeSci,2015,72(6):1175–1184.癌症基因编辑动物模型小细胞肺癌(Smallcelllungcancer，SCLC)是一种高度侵袭性的神经内分泌肺癌，约占所有肺癌病例的13%–15%。SCLC生长速度快、易发生复发和转移。NgSR,RideoutIIIWM,Akama-GarrenEH,etal.CRISPR-mediatedmodelingandfunctionalvalidationofcandidatetumorsuppressorgenesinsmallcelllungcancer.ProcNatlAcadSciUSA,2020,117(1):513-521.癌症基因编辑动物模型肝癌是指发生于肝脏细胞的恶性肿瘤，分为原发性肝癌和继发性肝癌。手术切除和放化疗仍是临床治疗的主要手段，但易造成复发和转移，使得肝癌患者预后很差，5年生存率仅为14.1%。XueW,ChenSD,YinH,etal.CRISPR-mediateddirectmutationofcancergenesinthemouseliver.Nature,2014,514(7522):380-384免疫缺陷类疾病基因编辑动物模型获得性免疫缺陷综合征(Acqiredimmredeficiencysyndrome，AIDS)病毒是一种逆转录RNA病毒，被定名为人类免疫缺陷病毒(HIV)，主要攻击并大量破坏人体免疫系统中最重要的CD4+T淋巴细胞，使得机体细胞免疫功能显著降低，最终导致机体感染病原体的机会增加或产生恶性肿瘤而死亡。CRISPR/Cas9等基因编辑技术可能从多个HIV储存库中清除或破坏HIV整合基因组或HIV感染细胞，这为将来完全治愈AIDS提供了技术支持。代谢性疾病基因编辑动物模型家族性高胆固醇血症(Familialhypercholesterolemia，FH)是一种造成人体脂代谢紊乱的遗传性疾病，突变的低密度脂蛋白受体会引发低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、黄瘤和严重的动脉粥样硬化性血管等临床症状。HuangZ,TomitakaA,RaymondA,etal.CurrentapplicationofCRISPR/Cas9gene-editingtechniquetoeradicationofHIV/AIDS.GeneTher,2017,24(7):377–384.代谢性疾病基因编辑动物模型糖尿病是一种终生代谢性疾病，严重威胁人类健康。大鼠和小鼠动物模型越来越多地被用来阐明类型1和类型2糖尿病机制以及识别和提炼新的治疗方法总结目前利用CRISPR/Cas9技术已经成功构建了多种动物模型,基因敲除或敲入模型的构建为探究相关基因功能及作用机制奠定了理论基础。疾病模型的构建为相关疾