新教材高中生物选择性必修3课件1：3 2 1 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建(人教版)

第3章基因工程第2节第1课时目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建？

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？

科学家将苏云金杆菌的“杀虫基因”——Bt抗虫蛋白基因转到棉花里，让棉花也能产生产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。转基因抗虫棉非转基因抗虫棉从社会中来一、目的基因的筛选和获取在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因。

目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。目的基因“杀虫基因”—Bt抗虫蛋白基因目的基因（1）方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。（2）实例：苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害；苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关；科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白也有较为深入的了解。因此，筛选Bt基因作为培育转基因抗虫棉的目的基因。一、目的基因的筛选和获取1筛选合适的目的基因（1）PCR：是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。一、目的基因的筛选和获取2利用PCR获取和扩增目的基因（2）DNA体内复制的条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸体内复制的引物为RNA单链。一、目的基因的筛选和获取一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（3）DNA体外复制（PCR）的条件参与的组分在DNA复制中的作用90℃以上高温DNA母链*4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶引物缓冲液（含Mg2+)提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链（变性）催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶一、目的基因的筛选和获取体外复制的引物一般为DNA单链（4）扩增的过程①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链；②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

如此重复循环多次，由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。一、目的基因的筛选和获取一、目的基因的筛选和获取

用PCR可以扩增mRNA吗？

mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：一、目的基因的筛选和获取第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。（1）构建基因文库来获取目的基因：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。①基因组文库：含有一种生物的全部基因。提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接基因表达载体导入受体菌中储存基因组文库②部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA反（逆）转录酶单链互补DNADNA聚合酶双链DNA片段与载体连接基因表达载体导入受体菌中储存cDNA文库一、目的基因的筛选和获取3获取目的基因的其他方法真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因一、目的基因的筛选和获取不含非编码序列。即不含非编码区和内含子基因组DNA文库与cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）基因多少物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以一、目的基因的筛选和获取（2）利用化学方法人工合成①需要仪器：DNA合成仪。②适用目的基因类型：要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知；③不需要模板。一、目的基因的筛选和获取让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。二、基因表达载体的构建（核心）1操作目的启动子（1）启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游（首端），紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子。诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达。目的基因限制酶切割位点复制原点标记基因终止子二、基因表达载体的构建（核心）2基因表达载体的构成启动子（2）终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游（尾端），标志着转录的停止。目的基因限制酶切割位点复制原点标记基因终止子（3）标记基因①作用：便于重组DNA分子的筛选。②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。（4）目的基因：如Bt基因。（5）复制原点作用：使能完成自主复制。二、基因表达载体的构建（核心）质粒启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点限制酶目的基因限制酶切割位点限制酶获取目的基因连接酶重组DNA分子载体（质粒）含有目的基因的DNA片段同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割带有黏性末端（或平末端）的切口带有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）基因表达载体构建模式图二、基因表达载体的构建（核心）3基因表达载体的构建将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？

有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。二、基因表达载体的构建（核心）

同一种限制酶切割获得的目的基因和载