新教材高中生物选择性必修3课件：3 2 1 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建(人教版)

第1课时

目的基因的筛选与获取、

基因表达载体的构建1.简述PCR的原理、条件及过程。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。学习目标一、目的基因的筛选与获取二、基因表达载体的构建网络构建课时对点练内容索引一、目的基因的筛选与获取1.培育转基因抗虫棉的四个步骤(1)目的基因的

。(2)

的构建。(3)将目的基因导入

。(4)目的基因的

。2.目的基因(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期

等的基因就是目的基因。教材梳理预习新知夯实基础筛选与获取基因表达载体受体细胞检测与鉴定表达产物(2)作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指____________的基因。(3)实例：培育转基因抗虫棉用到的

，即Bt基因。3.筛选合适的目的基因：从

的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。4.获取目的基因的方法(1)

目的基因。(2)常用

特异性地快速扩增目的基因。(3)通过构建

来获取目的基因。编码蛋白质Bt抗虫蛋白基因相关的已知结构和功能清晰人工合成PCR基因文库5.利用PCR获取和扩增目的基因(1)含义：PCR是

的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的

与

，对目的基因的

进行大量复制的技术。(2)原理：

。(3)基本条件①场所：在一定的

溶液中进行，其中一般要添加Mg2＋。②模板：DNA母链。③原料：4种

。聚合酶链式反应各种组分反应条件核苷酸序列DNA半保留复制缓冲脱氧核苷酸④酶：

的DNA聚合酶。⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的

端开始连接脱氧核苷酸。(4)过程①变性：当温度超过

℃时，双链DNA

为单链。②复性：当温度下降到

℃左右时，

通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：当温度上升到

℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在____

的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。(5)鉴定：常采用

来鉴定PCR的产物。耐高温3′90解聚50两种引物72耐高温的DNA聚合酶琼脂糖凝胶电泳判断正误(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(

)(2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚(

)(3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温(

)(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高(

)××√√探讨点PCR扩增技术图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：核心探讨突破重难强化素养1.图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？提示第3轮。2.图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。提示第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。3.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？提示要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。4.如果循环n次，则共需消耗多少对引物？提示共需消耗2n－1对引物。1.比较PCR扩增技术和体内DNA复制的异同核心归纳项目体内DNA复制PCR扩增技术解旋方式解旋酶催化DNA在高温作用下变性解旋场所细胞内(主要在细胞核内)PCR扩增仪内酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶温度条件细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行结果DNA分子DNA片段或目的基因相同点(1)模板：均需要DNA的两条单链作为模板；(2)原料：均为4种脱氧核苷酸；(3)酶：均需DNA聚合酶2.PCR中的数量关系复制次数123nDNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n含其中一种引物的DNA分子数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同时含两种引物的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的对数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数0＝21－20＝22－42＝23－62n－2n1.下列有关PCR技术的说法，错误的是A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B.PCR技术的原理是DNA分子半保留复制C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.PCR过程中只需要用到模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷酸原料典题应用及时反馈知识落实√解析PCR过程中需要模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等，D错误。2.(2021·山东济南章丘四中质检)下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对原则相同√解析DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。二、基因表达载体的构建教材梳理预习新知夯实基础1.基因表达载体构建的目的让目的基因在受体细胞中

，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够

和

。2.基因表达载体的组成稳定存在表达发挥作用启动子上游RNA聚合酶终止子下游转录标记3.基因表达载体的构建过程(1)首先用一定的

切割载体。(2)然后用

限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。(3)再利用

将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处(如图所示)。限制酶同种DNA连接酶(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取(

)(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子(

)(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因(

)(4)当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制目的基因的表达(

)判断正误××√√探讨点基因表达载体的构建方法请结合下图，回答问题：核心探讨突破重难强化素养1.构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？提示不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。2.与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？提示可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。1.区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子：启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。2.图解限制酶的选择原则核心归纳(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。3.下图为基因表达载体的模式图，下列有关说法，错误的是典题应用及时反馈知识落实A.基因表达载体的构建是在生物体外完成的B.任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C.图中启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选√4.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNAB.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反

向连接D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长√解析切割目的基因时，用BamHⅠ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和HindⅢ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用PstⅠ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。网络构建从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选利用PCR获取和扩增目的基因目的基因标记基因启动子终止子复制原点课时对点练题组一目的基因的筛选与获取1.下列关于PCR技术的叙述，正确的是A.PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上B.该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶C.该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的D.该技术应用DNA半保留复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件对点训练12345678910111214151617√1813解析PCR技术扩增的目的基因序列不一定完全是已知的，A项错误；该技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B项错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链进行碱基互补配对，其序列不是互补的，C项错误。1234567891011121415161718132.PCR又称聚合酶链式反应，现在已成为分子生物学实验中的一种常规手段，它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。你认为下列符合在体外进行PCR反应条件的一组是①稳定的缓冲溶液环境②DNA模板③引物④4种脱氧核苷酸⑤耐高温的DNA聚合酶⑥解旋酶⑦限制性内切核酸酶⑧温控设备A.①②③④⑤⑥ B.①②③④⑤⑥⑦⑧C.③④⑤⑥⑧ D.①②③④⑤⑧123456789101112151617141813√解析PCR反应的实质是模拟体内DNA复制，因此需要稳定的缓冲溶液环境，①正确；PCR反应需要DNA模板，②正确；PCR反应需要一对引物，③正确；PCR反应需要以4种脱氧核苷酸为原料，④正确；PCR反应需要耐高温的DNA聚合酶催化延伸过程，⑤正确；PCR反应过程中通过高温使DNA变性解链，不需要解旋酶，⑥错误；PCR反应不需要限制性内切核酸酶，⑦错误；PCR反应过程中需要控制的关键因素是温度，因此需要温控设备，⑧正确。1234567891011121516171418133.实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增，下列相关叙述不正确的是A.PCR反应中目的基因呈指数形式扩增B.反应过程包括变性→复性→延伸C.90℃以上时双链DNA的氢键断开D.引物与模板结合后向引物的5′端方向延伸DNA链1234567891011121516171418√解析引物与模板结合后向引物的3′端方向延伸DNA链，D错误。134.基因a在人体细胞中可表达出蛋白质a。有生物学家从人的DNA中分离出基因a，并通过转基因技术将其转入了细菌。经过培养发现，该转基因细菌产生了一种新蛋白质X。进一步分析表明：蛋白质X是基因a仅在细菌中的表达产物。下列说法正确的是A.基因a在体外扩增需要引物，在人体细胞中的复制不需要B.细菌细胞和人体细胞中作为翻译模板的RNA碱基序列不同C.基因a在体外扩增和在人体细胞中复制都是在解旋酶的作用下打开双链D.将基因a在体外扩增时，必须要先测出基因a的所有脱氧核苷酸序列123456789101112151617141813√解析基因a是目的基因，在体外扩增需要引物，在人体细胞中的复制也需要，A错误；基因a在人体细胞中表达产物是蛋白质a，而在细菌细胞中的表达产物是蛋白质X，这说明人体细胞和细菌细胞中作为翻译模板的RNA碱基序列不同，B正确；基因a在体外扩增时，利用高温打开DNA的双链，C错误；将基因a在体外扩增时，不需要测出基因a的所有脱氧核苷酸序列，D错误。123456789101112151617141813题组二基因表达载体的构建5.如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是123456789101112151617141813A.目的基因插入位点 B.启动子C.标记基因 D.DNA聚合酶识别位点√解析基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于基因的上游，所以X最可能是启动子，B正确。1234567891011121516171418136.在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要①DNA连接酶②限制性内切核酸酶③RNA聚合酶④具有标记基因的质粒⑤目的基因⑥四种脱氧核苷酸A.③⑥ B.②④ C.①⑤ D.①②④12345678910111215161714√1813解析构建重组质粒时，首先要用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，其次需要用DNA连接酶将目的基因与质粒连接；RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要RNA聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由目的基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。1234567891011121516171418137.(2021·山东莱州一中高二月考)下列关于基因表达载体的说法，不正确的是A.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤B.基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等C.终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程D.不同的目的基因所需的启动子不一定相同123456789101112151617141813√123456789101112151617141813解析基因表达载体使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用，是基因工程的核心步骤，A正确；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段DNA片段，终止子位于目的基因的下游，能够终止转录过程，B正确、C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。8.下列关于基因表达载体构建的相关叙述中，不正确的是A.需要限制酶和DNA连接酶B.抗生素抗性基因可作为标记基因C.在细胞外进行D.启动子位于目的基因的上游，是DNA聚合酶识别和结合的部位123456789101112151617141813√解析启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段DNA序列，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D错误。9.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是A.切割含抗虫基因的DNA片段和载体必须用同一种限制酶B.抗虫基因表达载体中要有起始密码子C.抗虫基因表达载体必须具备标记基因，其作用是筛选含有目的基因的

受体细胞D.抗虫基因的表达开始于复制原点123456789101112151617141813√解析切割含抗虫基因的DNA片段和载体可以用不同的限制酶，只要切割出的末端相同即可，A项错误；抗虫基因表达载体的构建必须具备启动子和终止子，起始密码子位于mRNA上，B项错误；基因表达载体必须具备标记基因，其作用是检测目的基因是否导入到受体细胞中，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来，C项正确；抗虫基因的表达开始于启动子，D项错误。12345678910111215161714181310.(2021·广东汕头潮南实验学校高二月考)某目的基因两侧的DNA序列所含的限制性内切核酸酶的酶切位点如图所示，最好选用下列哪种质粒作为载体123456789101112151617141813√解析目的基因仅一侧含有限制酶NheⅠ的识别序列，用此酶切割不能获取目的基因，A项错误；目的基因两侧分别含有限制酶AluⅠ的识别序列，但只用此酶切割可能会导致目的基因和质粒反向连接或自身环化，B项错误；目的基因两侧含有限制酶NheⅠ和AluⅠ的识别序列，但用这两种酶切割会产生不含目的基因的片段，C项错误；目的基因两侧分别含有限制酶NheⅠ和SmaⅠ的识别序列，用这两种酶切割会获取目的基因，而且能防止目的基因和质粒的自身环化和反向连接，D项正确。12345678910111215161714181311.用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的综合强化123456789101112151617141813√解析利用PCR技术将DNA分子中的A1片段扩增时，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸总是从5′端到3′端。据此依题意和图示分析可知，扩增后得到的绝大部分DNA片段如图D所示。12345678910111215161714181312.(2021·山东临沂高二期中)新型冠状病毒的检测可以采用实时荧光RT－PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法，RT－PCR的具体过程如图，下列叙述正确的是1234567891011121516171418A.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶B.过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要2n个引物BC.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度D.PCR反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关13√解析PCR体系中需要的是耐高温的DNA聚合酶，不是从受体细胞中提取的DNA聚合酶，A错误；过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n－1个引物B，B错误；利用实时荧光RT－PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测，C正确。12345678910111215161714181313.环境雌激素(EEs)会影响动物和人类的性腺发育。斑马鱼在EEs的诱导下，会表达出卵黄蛋白原(vtg)。已知绿色荧光蛋白(GFP)基因能使斑马鱼发光，欲获得能检测水中是否含有EEs的转基因斑马鱼，下列操作合理的是A.将EEs基因的启动子与GFP基因重组B.将vtg基因的启动子与GFP基因重组C.将GFP基因的启动子与GFP基因重组D.将GFP基因的启动子与vtg基因重组123456789101112131516171418√12345678910111215161714解析由题意可知，环境中的EEs可诱导斑马鱼体内vtg基因的表达，在不含EEs的环境中，斑马鱼体内vtg基因不能表达。因此，只要将vtg基因的启动子与GFP基因重组并导入斑马鱼体内，便能根据斑马鱼是否发光检测水中是否含EEs。181314.如图所示为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因与该质粒构建重组质粒，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列123456789101112131516171418A.NdeⅠ和BamHⅠ B.NdeⅠ和XbaⅠC.XbaⅠ和BamHⅠ D.EcoRⅠ和KpnⅠ√注：图中不同限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同。解析构建重组质粒时，要将目的基因插入到启动子和终止子之间，而且不能破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位，故只能选用NdeⅠ和BamHⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段，因此在PCR扩增的该基因的两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ两种限制酶的识别序列。12345678910111213151617141815.蜘蛛丝是天然蛋白纤维，其机械性能高于常用于制作防弹衣的凯夫拉纤维，有广泛的应用前景。近期，中国科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是123456789101112151617141813A.为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因B.构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动

子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达C.启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，

可以驱动遗传信息的复制和转录D.基因表达载体中的标记基因可以鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞√解析用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因，可以使目的基因两端产生不同的黏性末端，防止目的基因自身环化，A正确；123456789101112151617141813为能从蚕丝腺细胞中提取蛛丝蛋白，基因表达载体中目的基因的上游必须含有使其能在蚕丝腺细胞中转录的启动子，即构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达，B正确；启动子只能驱动基因转录，不能驱动其复制，C错误。16.在基因工程中利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是123456789101112151617141813A.构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ

切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体B.构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1

噬菌体载体C.图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团D.用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶

连接，只能产生一种重组DNA√123456789101112151617141813解析由题图可知，BglⅡ、Sau3AⅠ及EcoRⅠ三种酶在目的基因和P1噬菌体上都有酶切位点，且Sau3AⅠ的酶切位点在EcoRⅠ的左侧，故可用BglⅡ和Sau3AⅠ或EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，A、B项正确；从图乙知P1噬菌体载体为环状DNA，只用EcoRⅠ切割后产生两条反向双螺旋链状DNA，含有2个游离的磷酸基团，C项正确；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，能产生不止一种重组DNA，D项错误。17.基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是

。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是

。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的

。(2)目前在PCR反应中不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_______

。123456789101112151617141813解旋酶加热至90℃以上氢键大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活(3)含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶，这两种酶对DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰，使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。含有某种限制酶的细胞，可以利用限制酶切割外源DNA，但不破坏细胞自身的DNA，其原因可能有：①___________