阿奇霉素（一）亚微乳;稳定性;药物动力学;生物利用度

沈阳药科大学硕士学位论文1本研究建立了一种利用离子对试剂(庚烷磺酸钠)测定阿奇霉素含量的高效液相色谱pH值的增大而增大，阿奇霉素在pH6.0~6.5范围内相对稳定。阿奇霉素在大豆油、红花油、蓖麻油等长链油中的溶解度均低于5mgg¹,而在中链油(MCT)中的溶解度约为甘油2.2%、EDTA-2Na0.05%、苯扎溴铵0.003%加至适量注射用水中，至磁力搅拌器中相；将阿奇霉素1%、大豆磷脂1.8%和硬脂胺0.3%在75℃加热搅拌下溶于适量无水乙醇以上方法所制得的阿奇霉素亚微乳滴眼液三批样品的理化性质测定显示其平均粒径188.6±67.517nm,ζ-电位24.40mV,含量101.8%,包封率90.1%。振摇及冻融稳定性试验6个月和6±2℃条件下长期留样6个月试验考察，各项理化性质没有显著变化，都在合格2果表明阿奇霉素亚微乳剂和普通溶液剂在家兔泪液中的药动学行为相似，AUCo-t分别为(2461.583±885.257)和(1532.389±441.595)μg·mL¹·h,Ti₂分别为(3.898±1.325)和(2.388±0.815)h。说明阿奇霉素亚微乳滴眼液滴眼后在结膜囊内的滞留时间比溶液剂长，并且生度有所提高。关键词：阿奇霉素；亚微乳；稳定性；药物动力学；生物利用度沈阳药科大学硕士学位论文Abstract3Azithromycin(AZI),knownasasyntheticmacrocycliclactobacterialconjunctivitiscausedbyawiderangeofpathogenicbacteriumsuchasstaphylococcustreptocossus,rod,mycoplasmaandchlamydia.IthordertopalyadvantagesofAZIinthetreatmentofeyeinfectionsandtoovercometheproblemsoftraditionaldosagessuchaslowbioavailabiAnHPLCmethodinuseofion-pairreagents(sodiumheptanesulfonate)wasestablishedfordeterminationofAZI,themethodvalidationswerecarriedstabilityandoilphase-waterphasepartitionofAZIwerecloselyrelatedwiththeByincreasingthepHofmediums,thesolubilitydecreasedandtheoilphase-waterphasepartitionturnedhigher.AZIwasrelativelystablewithpH6HighpressurehomogenizationmethodwaandpreparingprocessofAZIEwereasfollows:Tween800.4%,F680.4%,EL-400.3%,glycerol2.2%,EDTA-2Na0.05%andbenzalkoniumbromide0.003%weredissolvedinwaterforinjectionstirringat70℃toobtainawatstearylamine0.3%wereco-dissolvedinethanolwitmixedwiththeoilphase.Theethanolwasremovedbyevaporationunderastreamofnitrogen,andaclearoilphasewasobtained.Theoilphasewasaddedtahigh-shearmixerat10,000rpmabout5minuemulsionwaspassedthroughahighpressurehomogenizer(70MpThecharacterisicsincludin沈阳药科大学硕士学位论文Abstract4threebatchesofAZIEwere188.6±67.517nm,24.40mV,101.8%and90.1%,respectively.stability.Itwasapplicamoreprominentadvantageinviscosity,surfacetension,aswellasphysicalpropertiessuchaschemicalstability.ThephysiochemicalcharactersUPLC/MS/MSmethodwasestablishedtodeterminpharmacokineticsshowedthatAZIEandAZIShadsimiAUCo-tandTirofAZIEandAZISwere(2461.583±885.257)and(1532.389±441.595)μg·mL¹hand(3.898±1.325)and(2.388±0.815)h,respectively.TheresultsshowedthatcomparedwithKeywords:Azithromycin;sub-microemulsion;stability;pharmacokineti5在所有的感觉中，视觉具有最重要的意义。现代科学研究表明，至少有80%以上的外界信息是由视觉系统所接受、处理和感知。眼睛是人类感知世界的窗口，同时又是极其敏感的器官。许多眼部疾病，如得不到及时的治疗最终将导致失明。随着现代社会生活水平的提高、眼疾患者的增加和眼部保健要求的提高，眼用药物的研究开发正呈现高速增长趋势。据统计，85%~90%的急、慢性眼部疾病可以通过药物治疗得到治愈或缓解。使用适宜的药物能够有效的缓解或控制病情的发展，而选择合理的剂型，则能够保证眼部用药的安全有效并使病人乐于接受。结膜囊内给以滴眼剂是最常见的药物治疗眼部疾病的方法[1]。据统计，眼用制剂中水溶液剂占有60%以上的比例。因其使用方便和价格低廉而容易被广大患者所接受2]。但在广泛的临床应用过程中，一般滴眼剂约有70%的药液直接从眼中溢出，若眨眼有的药液损失达90%。其水溶液制剂由于受泪液稀释、鼻泪管排泄等因素影响，暴露出容易被泪液稀释，很快从泪道排出，生物利用度极低(1%~10%)[3,仅有少于5%的药物透过角膜到达眼大量药物经鼻泪管进入鼻或消化道最终被全身吸收，增加了诱发副作用和毒性的风险。因此，传统眼部药物剂型归纳出的局限性：①吸收率差，利用率低，药物难以达到持久治疗的效果；②靶向性差，水溶性滴眼剂或者眼膏都不同程度存在靶向性差的特点，药物靶向治③毒性较大，经过眼部给药易造成周边组织药物毒性；④剂型不稳定，药物稳定性较差，存放条件苛刻，存储、运输条件都增加了药物的生产成本，不利于工业化生产。为了克服上述种种不利因素，人们设计了各种药物传递系统以期增加药物在眼部的吸收，从而提高药物在眼部的疗效和生物利用度。解决的目的主要集中于延长药物与眼球表面的接触时间，改善药物在角膜的通透性。正如前文所述，针对现有眼用制剂存在的先天不足，在眼部药物传递研究领域开展有益的探索尤为必要。二、眼部组织结构特征和药物吸收特征6前弹力层、基质层和后弹力层共占角膜厚度的90%。研药后，药物结膜通透性通常是角膜的2~30倍。图1眼睛解剖图Fig.1AnatomicalChartofhumaneye眼用药物的吸收包括：局部用药的眼内吸收(角膜吸收和非角膜吸收)、局部用药的全身吸收和全身用药的眼内吸收(眼内通透性)。药物在眼部的吸收途径见图2。滴入结膜囊内的药液立刻被泪液稀释，据测定结膜囊的最大液体容量为20~30μl。除去10μl的正常泪液，7最多只能容纳20μl的药液，多余的药液在与泪液混合前即已大部分溢出眼外。因此泪液的分布，排出和容量对药物的吸收起着重要的作用。药物在泪液中的饱和度和在结膜囊内保存的时间会直接影响药物对角膜的通透量。而在结膜囊内已与泪液混合的药液，也只有一小部分转运入眼，大部分随泪液从泪小管排出(据测定，排出速率约比药物吸收入眼的速率快10倍)或经眼睑及结膜血管吸收进入血液系统。由此可知，滴眼液的生物利用度是很低的(约1%~10%)。眼内吸收少于剂量的5%体内吸收(约泪液引流、咽图2泪液中药物吸收途径示意图Fig.2Absorptionroutesofatopicallyappliedophthalmicdrug大环内酯类抗生素发现至今，已经历了40多年的发展，至今仍在各种感染性疾病中亚Pliva公司研制，并于1988年在世界范围内上市。阿奇霉素的分子式为C₃8H₇₂N₂O₁2,分子量为749.00,其结构式见图3。阿奇霉素为15元环大环内酯类抗生素，与红霉素相比，其在酸中化学性质稳定6,在素具有更广泛的抗菌谱7,能抑制多种革兰阳性球菌、支原体、衣原体及嗜肺军团菌，尤8组织分布广，对组织有较高亲合力，选择性强，组织浓度高于血浓度10~100倍，组织半衰期2~4天。因此，每日只需给药一次，连续3天，可维持有效浓度8~10天。阿奇霉素00图3阿奇霉素的结构式Fig.3StructureofAzithromycin(AZI)自20世纪30年代青霉素和磺胺药物问世至今，抗菌药在防治多种病菌引起的疾病方的领军品种。据统计，国内抗感染药品市场占国内市场份额31%以上，约600亿元。目前国内市场阿奇霉素市场容量在5亿元左右，注射用药约1亿元，已成为治疗感染的一线药物。但是目前国内阿奇霉素临床常用的剂型除注射剂以外，多为片剂、胶囊剂等口服剂型，沈阳药科大学硕士学位论文前言9全身用药的不良反应涉及面较广，不仅累及心、肝、肾等主要脏器，还有造血系统、神经系统、肌肉骨骼系统等，过敏性休克的发生率较高(占29.8%)。临床应用总不良反应率约12%,主要为消化道反应，表现有恶心、呕吐、腹痛、腹泻、腹胀等。因此，为了发挥阿奇霉素在眼部感染疾病治疗中的优势，降低全身不良反应的发生率，拓宽阿奇霉素的给药途径，研制新的剂型势在必行。四、阿奇霉素亚微乳滴眼液可行性分析急性细菌性结膜炎是一种多发于夏秋季传染性极强的以细菌为病原体的急性结膜炎症，是日常眼科初诊遇见频率最高的眼部疾患。细菌性角膜炎、结膜炎常致眼组织不同程度的损害，有时后果严重，危害视力。细菌性结膜炎的致病菌种类很多，对角膜、结膜组织的损伤程度各异。其诊断与治疗不难，但由于临床上滥用抗菌素，导致耐药菌株的逐渐增多，给临床药物应用增加了困难。阿奇霉素是一种大环内酯类广谱抗生素，对各种葡萄球菌、链球菌、杆菌、支原体、衣原体均敏感，对以下多种致病菌所致的结膜感染均有效：棒状杆菌群；轻型链球菌群；流感嗜血杆菌；金黄色葡萄球菌；肺炎链球菌，已经被世界卫生组织列入到防治沙眼性结膜炎等眼部感染性疾病的重点药物。眼科大多数药物是滴眼剂给药的，这是眼科用药的一大特点，这种给药途径能使眼前段达到适当的药物浓度，又不至于引起全身其他系统的严重不良反应，与全身给药相比具有明显的优点9,10]。相对地讲，眼部给药比2007年4月27日FDA批准由美国InSiteVision公司生产的商品名为AzaSite的阿奇霉素滴眼液在美国上市，用于细菌性结膜炎的治疗。国外上市阿奇霉素滴眼液Ⅱ期临床试验结果显示，它安全有效，可达到临床解决由格兰氏阳性和阴性菌引起的急性细菌性结膜炎的目标。但作为传统的眼用制剂，它势必也存在滞留时间短、生物利用度低等一系列问题，并且临床应用主要的不良反应为眼部刺激性。为了提高眼部生物利用度，延长作用时间，眼部给药主要集中在研究新剂型给药系统方面，如胶粒系统、微粒系统、凝胶系统、眼部插入剂和植入剂、给药装置等[11,12],取得了一定的进展。近年来，脂肪乳剂作为药物传递系统在制药领域也正发挥着越来越重要的作用。脂肪乳剂的特殊的理化特性和低毒性决定了其可以作为水溶性或脂溶性药物，特别是抗癌药物、麻醉药物及抗炎药物的良好载体。伴随着纳米分散技术近年来取得的重大进展，国内外学者对纳米分散技术在药物制剂上的应用进行了许多探索研究。其中，以亚微乳剂为药物载体的纳米分散给药系统是研究的热点之一，其作为一种新型药物传递系统能的关注。Ding和Coll¹4研究了一种以蓖麻油作为油相的o/w型环孢素A脂肪乳剂，并通环孢素A乳剂的有效性[15,因此于2002年美国FDA批准了该种含有质量分数为0.05%的环孢素A(商品名为RestasiseM)阴离子o/w型脂肪乳剂上市。实验结果表明，以脂肪乳剂因此综上所述，阿奇霉素对多种致病菌所致的结膜感染有效，本论文在前人研究的基础上选择将其制成化学稳定性高、耐用性好、生物利用度高的眼用亚微乳滴眼液是可行的，并且具有大规模工业化生产和临床应用前景。参考文献[1]DaviesNM.Biopharmaceuticalconsiderationsintopicaloculardrugdelivery.C2000,27:558-562.[2]AlanyRGRadesT,Nicolofocularirritationandprecornealretention.JControlRelease.2006,111:145-152.[3]RonDagani.IntelligeInc,NewYork,1992,pp,269-300.[5]LeeVHL.Ophtlalmicdrugdeliverysysterms.OphthalmicNewYork,1993,pp,59-81[6]李家泰，刘健，张烁，等.新氨基糖苷抗生素体外抗菌作用的研究[J].中国抗生素杂志.1995,20(6):[7]FieseEF,etal.ComparisionoftheacidstabilityofazithromycinandeChemother.1990,25(S-A):39-47.[8]洪琅.阿奇霉素的基础研究和临床评价[J].中国药学杂志.1995,30(11):687.[9]KaurIP,KanwarM.Ocularpreparations:theformulationapproach.DrugDev[10]ChanJ,MaghrabyGMME,Cdrugdeliverysystems:InvitroandinvivoevalRes.1998,17(1):33-58.[12]吕慧侠，周建平.眼部给药系统的研究进展[J].药学进展，2004,28(3):104-108.[13]孟玉芳，龚明涛，张钧寿.含药静脉注射用脂肪乳剂的研究进展[J].中国医药工业杂志.2004,35(9):[14]DingS,TienW,Olejniko.Nonirritatingemulsionsforsensitibetissue:US,5474979[P].1995-[15]StevensonD,TauberJ,ReisBL.Efficacyandtreatmentofmoderate-to-severedryeyedisease:Adose-ranging,randomizedtrial,theCyclosporinAPhasStudyGroup[J].Ophthalmol.2000,107:967-974.[16]RigerGLipidcontainingeye201:206-212.第一章阿奇霉素亚微乳滴眼液处方前研究药物制剂的处方前研究(PharmaceuticalPreformulationStudies)是指在设计制剂处方前对药物的一系列基本的物理性质、化学性质和制剂性质的了解、分析、利用或改进。药物制剂的处方前研究在处方设计和产品开发中为选择最佳剂型、工艺和质量控制提供依据，使药物不但能保持其物理化学和生物学的稳定性，而且使制剂能获得较高的生物利用度和最佳疗效，并使制剂处方和制剂工艺适应工业化生产的要求1]。本章建立了一种准确、以及阿奇霉素的表观油水分配系数进行了考察，为进一步研究阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方、工艺和制剂稳定性提供了依据。Jasco高效液相色谱仪(日本Jasco株式会社);YKH-IⅡ型液体快速混合器(江西医疗厂);ZHWY-110X30往复式水浴恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司);电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司);PHS-250精密pH计(上海理达仪器厂);FA1104N分析天平(上海民乔精密科学仪器有限公司);ODS-C₁8色谱柱(5μm,150×4.6mm)(迪马公司);CTO-10ASVP柱温箱(日本岛津公司);SK3300H超声清洗机(上海科导超声仪器有限公司);1.2试药阿奇霉素原料药(上海三维制药有限公司);注射用大豆油(LCT)(铁岭北亚药用油厂);中链脂肪酸甘油三酯(MCT)(德国Lipoid公司);红花油(上海地源食品有限公司);蓖麻油(沈阳化学试剂厂)。甲醇、乙腈等均为色谱纯，其它药品和试剂均为药用规格和分析纯。2方法与结果2.1阿奇霉素体外分析方法的建立2.1.1紫外吸收特征取阿奇霉素原料药适量，用流动相溶解并稀释至适当浓度，以流动相作为空白对照，按分光光度法，在190~400nm波长范围内进行紫外扫描，结果如图1-1所示，阿奇霉素只有末端紫外吸收，且吸收较弱，参考文献采用紫外末端波长，即210nm为检测波长。2.1.2色谱条件甲醇溶解并用流动相稀释至刻度，超声5min,置具塞试管中涡旋2min,离心2.1.4方法专属性试验000BA2.1.5线性关系考察精密移取上述阿奇霉素储备液适量分别用流动相稀释成2.0,1.5,0.5,0.1,0.05mg/mL的溶液，各吸取20μL进样，记录峰面积，以浓度c(mg/mL)为横坐标，以峰面积A为纵坐标做线性回归，得回归方程为：结果表明在本色谱条件下，阿奇霉素浓度在0.05～2.0mg/mL范围内峰面积与测定浓度呈良好的线性关系。2.1.6回收率、精密度及稳定性考察精密吸取阿奇霉素储备液适量，分别配制高、中、低三种浓度的阿奇霉素对照品溶液(分别为0.5,1.0,1.5mg/mL)各五份，分别测定，记录峰面积，计算RSD%,考察日内精密度；同一溶液每日进样一次，连续测定五天，记录峰面积，计算RSD%,考察日间精密度及对照品溶液的稳定性；精密吸取阿奇霉素储备液适量，按处方比例加入辅料，配制成相当于阿奇霉素亚微乳滴眼液浓度(10mg/mL)的50%、100%和150%的高、中、低三个浓度的模拟制剂，每个浓度三份，然后分别按“样品溶液”项下处理，取20μL进样，HPLC法测定，由测得量和加入量计算回收率。结果见表1-1。2.2阿奇霉素溶解性能的测定药物无论通过何种给药途径，为了获得治疗效果，必须具有一定程度的溶解度。正常液体的体积有限，局部用药剂量小，一般提高制剂中药物浓度以达到治疗效果。因此药物必须有足够的溶解度满足制剂要求。2.2.1阿奇霉素在不同油相中溶解度的测定制备亚微乳剂常用大豆油和中链油作为油相，另外也有以红花油和蓖麻油作为乳剂油相的报道。在100mL具塞锥形瓶中，加入一定量的大豆油(LCT)、中链油(MCT)、蓖麻油(Castoroil)以及红花油(Saffloweroil),分别加入过量的阿奇霉素，置水浴恒温摇床(37℃,100rpm)中振摇3天，于室温(25℃)放置1天后，10,000rpm高速离心10min,然后分别取适量油相按“样品溶液”项下处理，取20μL进样，测定各介质中的平衡溶解度，结果如表1-2所示。表1-2中可以看出阿奇霉素在大豆油、红花油、蓖麻油等长链甘油三酯中的溶解度很小，在中链油中有一定溶解度。2.2.2阿奇霉素在不同pH值介质中溶解度的测定取过量的阿奇霉素分别置于pH4.0、pH5.6、pH7.0、pH8.0、pH10.0磷酸盐缓冲液中，置水浴恒温摇床(37℃,100rpm)中振摇3天，于室温(25℃)放置1天后。用0.22μm微孔滤膜过滤，取适量续滤液进行测定，结果见表1-3。由表中可以看出：①阿奇霉素难溶于水，pH值对其在水中的溶解度影响很大；②随着pH值的降低，阿奇霉素的溶解度逐渐增大；因此推测在酸性缓冲液中，部分阿奇霉素可能以盐的形式存在，故增大了其在水中的溶解度。表1-3阿奇霉素在不同pH值介质中的溶解度Tab.1-3TheSolubilityofAZIinaqueoussolpH4.0PhosphateBufferSo2.3阿奇霉素在不同pH值介质中的稳定性以pH7.0的磷酸盐溶液为溶剂配制100mg/mL的阿奇霉素溶液，分别取该溶液适量，用一系列不同pH值(pH4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5)的磷酸盐缓冲液稀释50倍制成约2mg/mL的溶液，分别于零时(加热前)、80℃水浴加热0.25h,0.5h,1h,2h,4h,8h,12h,24h不同时间取样，HPLC法测定样品浓度，并与零时样品比较，测定阿奇霉素在不同pH值介质中的稳定性。结果如图1-3所示。结果表明，阿奇霉素在pH6.0~6.5缓冲盐溶液中相对稳定。章阿奇霉素亚微乳滴眼液处方前研究2.4阿奇霉素表观油/水分配系数的测定表1-4阿奇霉素在不同pH值缓冲液介质中的表观油水分配系数Tab.1-4Determination3.1关于阿奇霉素的测定方法，中国药典2005版规定定有关物质，该方法周期长，操作繁琐2;美国药典采用反相氧化铝柱，安培电化学检测奇霉素含量的高效液相色谱法。方法基本原理如子对试剂，其阴离子部分可与带正电荷的氢离子复合物形成中性分子。所形成的中性分子带来了两方面的优点：第一，由于形成了中性分子，根据色谱柱相似相容的保留行为原则，增加了阿奇霉素的保留能力；第二，由于形成了中性分子，阿奇霉素分子上原有的孤对电子被掩盖(与氢离子结合),使拖尾现象基本消失，显著地改善了峰形，提高了柱效。我们根据现有条件及相关色谱知识，开发了高效液相色谱法测定阿奇霉素含量。经方法学考察证明，该色谱法科学有效并且易于使用。3.2要对亚微乳剂进行准确的定量必须在测定前破乳，常用的破乳溶剂有甲醇、异丙醇和乙醚等有机溶剂。但是在考察阿奇霉素亚微乳滴眼液破乳方法的试验中发现，单纯用传统的有机溶剂破乳能够改变药物在色谱柱中的微环境，从而改变了药物的保留行为，色谱峰时常出现鬼峰，影响了测定的准确性和重现性。所以本研究采用将样品加适量甲醇溶解并用流动相稀释，经超声、涡旋、离心，取上清液进样的方法进行测定，该破乳方法能够保证良好的药物峰形与较好的准确性和重现性。3.3由阿奇霉素在不同油相中溶解度的测定结果可知，阿奇霉素在大豆油、蓖麻油和红花油中的溶解度均小于5mg/g,远远不能满足阿奇霉素亚微乳滴眼液的载药规格要求。相比之下，阿奇霉素在中链油中有较大的溶解度，提示在制剂研究中我们可以将中链油作为油相来制备阿奇霉素亚微乳滴眼液。3.4研究药物在不同pH介质中的溶解度以及油/水分配系数对于药物在液体制剂中的存在状态有重要意义。由阿奇霉素在不同pH介质中的溶解度以及表观油/水分配系数的测定结果可知，阿奇霉素在水中的溶解度以及油/水分配系数都有明显pH依赖性。由阿奇霉素的结构可知，阿奇霉素在水溶液中会受H及OH的浓度影响而呈现不同的解离状态，pH值降低会使阿奇霉素增加解离成离子状态而提高在水中的溶解度，而提高pH值会使阿奇霉素以更多的分子状态存在，由于极性减小而增加在油相中的溶解度。结合阿奇霉素在不同pH介质中稳定性的测定结果，阿奇霉素在不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中的降解符合一级反应动力学，且受pH值影响很大，提示在阿奇霉素相对稳定的范围内适度提高pH值可以提高阿奇霉素在油相中的分布。4本章小结4.1本章确立了阿奇霉素的体外分析方法，以HPLC法测定阿奇霉素亚微乳滴眼液的含量，经方法学验证，所建立的分析方法专属性强、重现性好、准确度高，符合要求。4.2本章对阿奇霉素的溶解性能以及表观油水分配系数进行了考察，结果表明，阿奇霉素在水中的溶解度及表观油水分配系数与pH值密切相关，随着pH的增大阿奇霉素在水中的溶解度减小，表观油/水分配系数逐渐增加。4.3本章对阿奇霉素在大豆油、中链油、蓖麻油以及红花油等油相介质中的溶解性能进行了考察，结果表明，阿奇霉素在油中有一定的溶解度，并且在中链油(MCT)中的溶解能力大，提示我们在进行阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方研究中首先考虑以中链油(MCT)作为油4.4本章研究了以pH7.0的磷酸盐溶液为溶剂配制的阿奇霉素溶液经不同pH缓冲盐溶液稀释后，在80℃水浴加热条件下的降解动力学，确定了不同条件下的反应级数，计算了反应速率常数，并得到了阿奇霉素化学稳定性相对较好的pH范围，为阿奇霉素亚微乳滴眼液pH值的调节提供了依据。参考文献沈阳药科大学硕士学位论文第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究以亚微乳剂作为药物载体的纳米分散给药系统是研究的热点之一，其作为一种新型药物传递系统能够增加水难溶性药物的溶解度和稳定性，能够减轻药物的不良反应并具有一定的缓释作用，它不仅可以胃肠道给药，静脉给药，其在眼部给药中的优势及应用也越来亚微乳剂在热力学及动力学上均属于不稳定体系，虽然国内、外已有许多将营养性输液——脂肪乳剂成功地应用于临床，其处方及工艺亦已成熟，但是由于药物的加入会影响整个分散体系的结构，因此对于含药亚微乳而言，制剂的处方和工艺不尽相同，其中前者主要包括表面活性剂的组成及用量、油相的种类、处方的pH值等；后者主要为高压均质过程的温度、压力、次数等。根据文献报道14,乳剂的工艺条件如初乳的制备方法、高压均质的压力及次数、高压均质时乳液控制的温度等均会影响乳剂的粒度大小及分布并进一步影响其稳定性。本章主要以提高药物制剂的稳定性为目的，以亚微乳剂外观、粒径及粒度分布、5-电位、粘度、包封率及药物化学稳定性等为主要评价指标，对阿奇霉素亚微乳滴眼液进行了处方及制备工艺的全面考察筛选。Jasco高效液相色谱仪(日本Jasco株式会社);YKH-IⅡ型涡旋混合器(江西医疗器械厂);电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司);PHS-250精密pH计(上海理达仪器厂);FA1104N分析天平(上海民乔精密科学仪器有限公司);ODS-C₁8色谱柱(5μm,150×4.6mm)(迪马公司);CTO-10ASVP柱温箱(日本岛津公司);SK3300H超声清洗机(上海科导超声仪沈阳药科大学硕士学位论文第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究1.2试药肪酸甘油三酯(MCT)(德国Lipoid公司);聚山梨酯80(Tween80)(上海申宇医药化工有限公司);油酸(德国Lipoid公司);大豆磷脂Epikuron170(德国Degussa公司);蛋黄卵磷脂(德国有限公司);依地酸二钠(EDTA-2Na)(杭州余杭利人药业有限公司);VE(新昌制药厂);注射用甘油(浙江遂昌惠康药业有限公司);注射用水(沈阳市陆军总院药剂沈阳药科大学硕士学位论文第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究苯扎溴铵甘油注射用水加至100mL容至全量，转移至高压均质机中，以70Mpa压力均质8次；应用于生产市售的脂肪乳剂，是目前常用的制备亚微乳剂的方法，其工作原理(见图2-1)第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究调节压力为1500bar,二级阀的最大调节压力为150bar,一般一、二级阀的压力比为10左图2-1高压均质机工作原理示意图Fig.2-2Schematicrepresentationo(A)Hopper,(B)Icewaterbath,(C)Finis3.3制剂的评价指标3.3.1外观及性状沈阳药科大学硕士学位论文第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究阿奇霉素亚微乳滴眼液用肉眼观察为白色或类白色均匀乳状液体，未见不溶性成分或块状团聚物，显微镜下观察无阿奇霉素结晶析出，加蒸馏水适当稀释后可呈现淡蓝色乳光。3.3.2粒径及粒度分布亚微乳剂是热力学不稳定体系，具有自动聚合的趋势。粒径大(一般大于0.5μm),即使粒径分布较均匀，聚结的可能性也较大。因此，均匀的分散状态是乳剂物理稳定性良好的保证，微粒分散制剂的物理稳定性主要取决于粒子的平均粒径和粒度分布。目前，用于分散系统粒径和粒度分布测定的方法有动态光散射法(DLS)、显微镜法、光衍射法(LD)、光散射法(LC)、光阻法(LO)、电子感应区带法(ESZ)、光学感应区带法(OSZ)等多种方法。其中动态光散射法(Dynamiclightscattering,DLS)⁵是测定亚微乳粒径及粒度分布的较常用方法，又称光子相关光谱法(PhotonCorrelationSpectroscopy,PCS)或准弹性光散射法(QELS),该法测定范围宽，快速、简便，测定样品的粒径大小和分布不受粒子浓度影响，同时可排除粒子的内干涉及多点散射等现象的干扰6。动态光散射技术是指通过测量样品散射光强度起伏的变化来推算出样品粒子大小信息的一种技术。根据分子运动学的理论，悬浮在液体分散介质中的颗粒要受到周围介质的不断碰撞而作随机的布朗运动(热运动),颗粒越小，布朗运动越快，反之越慢。测量液体分散介质中颗粒的散射光强度，应用相关技术从散射光强度的起伏涨落中求得颗粒的平移扩散系数，再按Stokes-Einstein公式，求得颗粒的当量球形直径，所测定的粒径范围为5nm~3μm⁷,当粒子粒径>3μm时布朗运动对其作用甚微，并不适合DLS法测定。本文采用美国PSS公司的NicompTM380动态光散射粒度/S-电位测定仪测定亚微乳的粒径及粒度分布(ParticleSizeDiameter,PSD)。PSSNicomp粒度测定系统提供两种分析模型：Gaussian曲线分布和Nicomp多波形分布。其中，Gaussian曲线分布是将所测定的粒径结果按正态分布拟合，适用于粒度分布较均一且分布宽度较窄的体系；Nicomp多波形分布则是根据Stokes-Einstein方程，通过Laplace逆变换，按粒子大小分组给出多组真实的粒径分布图，可以较为客观、真实的显示体系的粒度分布情况，适用于更复杂的分布体系，如不对称的单峰体系或多峰体系8]。两者的选择由其系统给出的参数Chisquare的大小决定。Gaussian分布和Nicomp分布均以数量-重量径(PSDN)、体积-重量径(PSDv)、强度-重量径而PSDv结果则对大小粒子兼顾。由于大粒子的存在具有潜在的危险性，突出大粒子显得尤为重要，在本实验中，如未作说明，所给出的粒度测定数据均为Gaussian分布或Nicomp分布的强度-重量径(PSD1)。此外，在每一种粒径的表示方式中，还有50%、90%等粒径累第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究积值数据，粒径累积值可以统计出体系中较大的粒子，能较为真实的反映体系中乳滴大小的变化。使用NicompTM380动态光散射粒度/S-电位测定仪进行粒度测定的操作方法为：将样品用过0.22μm微孔滤膜的注射用水稀释约1000倍，立即放入样品池内，将光强度(Intensity)调节至300KHz左右，光源为HeNe激光(5mV,λo=632.8nm),将操作参数中温度设为测定时室温，开始测定，5分钟后保持测定至Timehistory曲线趋于直线时停止测定，保存数微粒的动电电位(zeta电位，5-电位)是微粒表面荷电性质与荷电大小的标志，是微粒分散系统的重要参数之一。它不仅影响微粒分散系统的物理稳定性，而且还影响其体内分布与体内药物动力学。根据DLVO理论，增加(-电位的绝对值可提高系统的稳定性[8,避免电泳激光散射技术(electrophoreticlightscattering,ELS)是将激光散射与显微电泳结合起来的新技术，采用激光散射精确地测定粒子在外电场作用下的动力学性质91,该法不仅可弥补显微电泳的不足，且测量速度快、分辨率高，适应范围广[10]。在带电粒子的溶液中加上一个外电场，带电粒子即以固定速度向与其电性相反的电极移动，与之相应的动力光散射光谱产生多普勒漂移，这一漂移正比于带电粒子的移动速度，因此实验测得谱线的漂移，就可求得带电粒子的电泳速度，从而求得ζ-电位。3.3.5含量参照第一章2.1项下测定阿奇霉素亚微乳滴眼液中阿奇霉素的含量。包封率(Entrapmentefficiency,EE)是评价载药亚微乳剂的一项重要指标。目前用于评价药物在乳剂中分布的方法主要包括：油水两相平衡分配法、超速离心法、离心超滤法及电沈阳药科大学硕士学位论文第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究动色谱法等。油水两相平衡分配法是简单地将药物置于油、水两相混合系统中，经振荡达到平衡后由两相的药物浓度求出药物的分配比例。但是在制剂中由于有乳化剂的存在，实际分布情况比简单两相的分配复杂，因此平衡分配法不能很真实客观地反应制剂中药物的分布情况。电动色谱法[(electrokiniticchromatograph)测定制剂的容量因子kcf(capacityfactor),并发现lgkcf与lgP(分配系数)呈直线关系，即lgkcf=algP+b,故认为lgkcf可以反映药物在制剂中的分配，或药物的亲水亲油特性。但是只有在测定条件下呈离子状态的药物才能采用这种方法。本文分别采用超速离心法及离心超滤法测定阿奇霉素亚微乳滴眼液铵0.045M,水相中加入离子对试剂庚烷磺酸钠使其浓度为0.002M,磷酸调水相pH3.0)-乙腈(47:15)为流动相；检测波长为210nm;灵敏度为0.005;流速为1.0mL/min;柱温为25℃;进样量为20μL;理论板数按阿奇霉素峰计算应不低于3000。线性范围考察阿奇霉素标准液的配制：精密称取阿奇霉素对照品1000mg置于100mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，得10mg/mL的高浓度储备液。精密量取储备液适量，以水相稀释至浓度为2.0,1.0,0.8,0.4,0.2mg/mL的系列溶液。试验结果表明：阿奇霉素在0.2mg/mL～2.0mg/mL浓度范围内峰面积与测定浓度呈良好的线性关系(r=1,n=5)。方法回收率和精密度分别取高、中、低三种浓度(1.5、1.0、0.5mg/mL)的阿奇霉素溶液，加入超滤离心接注入HPLC仪，测定其药物含量，并与初始溶液浓度比较计算方法回收率，回收率与操作次数的关系如图2-3所示。结果表明，当操作次数达到三次以上时，三种浓度的方法回收率均在90%以上，而且不再随着离心次数增加而显著改变，因此本实验将测定包封率时的离心次数定为按上述操作重复三次。0.32%和0.19%(n=3),说明该方法适用于阿奇霉素亚微乳滴眼液包封率的测定。沈阳药科大学硕士学位论文第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究Timesofcentrifugation测定与计算方法超速离心法(Ultracentrifugation,UC):取阿奇霉素亚微乳滴眼液4mL于离心管中，置超速离心机中以50,000rpm离心2h,温度4℃。以注射器取离心后样品下层澄清水溶液层，以水相稀释至适当浓度，以HPLC法测定。离心超滤法(Ultrafiltration,UF):取阿奇霉素亚微乳滴眼液3mL于超滤离心管中，置离心机中以3,000rpm离心15min,重复操作三次，合并离心套管中的超滤液，以水相稀释至适当浓度，以HPLC法测定。同时用NicompTM380动态光散射粒度/3-电位测定仪测定超滤计算方法：本试验中包封率(Entrapmentefficiency,EE)为药物在油相及界面层中的百分含量，即包封率(EE)%=[1-水相体积百分比×水相中药物浓度/药物总浓度]×100%4结果与讨论4.1处方因素的考察4.1.1油相的考察油相的种类在亚微乳剂的处方中起着至关重要的作用，不同种类的油相对亚微乳剂的物理化学性质和稳定性有很大的影响[12]。脂肪乳剂中油相的早期研究主要着重于长链甘油三酯(LCT)。长链甘油三酯是从植物中提取的，包括如大豆油、红花油、芝麻油、玉米油、沈阳药科大学硕士学位论文第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究蓖麻油等。以长链甘油三酯(LCT)为油相的脂肪乳在临床上应用已有30余年，目前临床常用的脂肪乳剂中，油相大多数以低毒性安全性高的注射用大豆油为原料，也有以其它植物油为原料构成。随着研究的深入，继LCT后，人们又通过将甘油和椰子油脂肪酸经过重新酯化而合成了中链甘油三酯(MCT)。MCT分子量较小，有较大的水溶性(中链甘油三酯在水中的溶解度是长链甘油三酯的100倍)及较低的pKa值，与长链甘油三酯相比，中链甘油三酯会提高对于药物的增溶能力。根据处方前阿奇霉素在不同油相介质溶解度测定的结果，阿奇霉素在大豆油、红花油、蓖麻油等长链甘油三酯中的溶解度很小，在中链油中有一定溶解度，后续研究中阿奇霉素与豆磷脂独特的加入方式也促进了阿奇霉素的溶解，以大于6.5%(w/v)的油相比例即能够满足制剂规格的要求。由于油相的比例和种类不但会影响脂肪乳剂的质量和稳定性[¹2而且会影响脂肪乳剂的优势作用，因此药物的包封率高低是评价亚微乳剂优越性的重要指标。因此本实验考察了不同比例MCT制备脂肪乳剂后乳剂的稳定性。实验方法为分别以MCT为6.5%(w/v)、8.5%(w/v)、10%(w/v)作为油相制备阿奇霉素亚微乳剂(10mg/mL)。所得样品以离心超滤法测定水相中药物含量，计算阿奇霉素的包封率，测定结果见表2-1。由上表可见，MCT比例对阿奇霉素亚微乳滴眼液的包封率确有很大影响，随着MCT在亚微乳剂中所占比例的增加，药物在油相及乳化剂层的分布增加，但当MCT比例由8.5%(w/v)增加至10%(w/v)时，制剂的包封率并未见明显增加。这种现象可能是由于油相用量变化的同时还会影响到乳化剂及高压均质力的作用，而药物在油相中及乳化剂层的最终分布是这些复杂作用综合影响的结果。另有文献报道[16眼用制剂最适宜的粘度范围应为2~3cP,这样既能保证较高的生物利用度又能使患者有较好的顺应性，因此我们选择8.5%(w/v)比例的MCT作为制备阿奇霉素亚微乳剂的油相比例，制成的乳剂在室温测定其粘度约为2.85cP。4.1.2乳化剂的考察第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究根据IUPAC[InternationalUnionofPureandAppliedChemistry]对脂肪乳剂的描述，脂肪乳剂是在一种液体中分散着另一种不相溶的液体或其液晶态。同时由于乳剂体系对于微小的变化都很敏感，很容易发生聚结、絮凝、合并，最终分层。由于药物的亲脂性、解离程度、分子量等理化性质不同，当药物包裹于乳滴后，通过疏水、静电或氢键作用与磷脂结合后可引起界面层性质的变化，从而改变乳剂原有的理化性质17-19]。Boyd等报道，提高脂肪乳剂这种不稳定体系稳定性的主要因素在于以液晶态存在的界面膜具有较好的黏弹性。通常，界面膜主要由分散体系中的乳化剂组成，加入乳化剂的意义在于：①乳化剂被吸附于乳滴的界面，有规律的定向排列成膜，使乳滴在形成过程中有效②在乳剂的制备过程中不必消耗更大的能量，就能形成具有一定分散度和稳定性的乳剂。为主乳化剂，助乳化剂从聚山梨酯80(Tween-80)、泊洛沙姆188(F-68)、聚氧乙烯蓖麻油(EL-40)等中进行筛选，以MCT(8.5%,w/v有亲脂性，故具有良好的乳化性能，自从上世纪60年代临床使用以来它的安全性得到了响其使用性能2]。本实验中所用磷脂为Deggusa公司的大豆磷脂170和Lipoid公司的蛋黄卵磷脂E80。大豆磷脂170中磷脂酰胆碱(PC)含量大于70%,磷脂酰乙醇胺(PE)大于8%;蛋黄卵磷脂E80中磷脂酰胆碱(PC)含量大于81.4%,磷脂酰乙醇胺(PE)大于8.1%。因此，大豆磷脂170在pH中性时带负电成分含量要高于蛋黄卵磷脂E80,相应的乳化能力也较沈阳药科大学硕士学位论文第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究(LipoidE80)在相同用量下，同样工艺制得的阿奇霉素亚微乳滴眼液初乳表面有大量油滴漂浮，含LipoidE80的终乳状态差，且加蒸馏水适当稀释后未呈现淡蓝色乳光。实验结果同Hansrani等人{22]指出的纯度高的磷脂酰胆碱(PC)或磷脂酰乙醇胺(PE)的乳化能力同天然磷脂相比较低的报道是一致的。因此我们选择大豆磷脂作为主要乳化剂，有利于提高亚微乳滴眼液的稳定性。本研究考察了不同大豆磷脂用量阿奇霉素亚微乳滴眼液的外观、粒径、包封率等，结果如表2-2所示。早有文献报道在所有亚微乳剂的水相中均存在由过量磷脂产生的小囊泡(SmallUnilamellarVesicles,SUVs)231,粒径约为50~100nm。该结构为封闭的双分子层结构，这就导致它的两条疏水链一个挨一个地指向内部，亲水的头基在膜的内外两个表面上，因此这些存在于水相中的小囊泡可以包裹药物分子。所以水相中的药物有两种存在形式：包裹于囊泡中的药物和未包裹于囊泡中的药物(即游离态的药物)。Nicomp多波形粒度分布结果也显示，在50~100nm之间有部分小囊泡存在且其对乳剂的稳定性无明显影响。以离心超滤法测定包封率，1.8%大豆磷脂的处方其包封率为90.5%,而超速离心法测得的结果仅为73.8%,原因还是由于磷脂量过大时会形成SUVs,SUVs的结构为磷脂双分子层包封着水相，其密度与水接近，即使高速离心很长时间仍存在于水相中，且长时间高速离心使亚微乳剂的结构破坏，这可能造成药物在体系中的重新分布，结果造成超速离心法水相中测得的阿奇霉素浓度偏高，包封率计算结果偏低。从表2-2中可以看出，当大豆磷脂用量低于1.5%时，以本试验确定的工艺条件无法制得亚微乳剂，初乳静止30min后即分层；大豆磷脂用量1.5%时乳化不够完全，样品表面会有油滴漂浮；当用量增到1.8%时刚好能制得外观良好、均一稳定且包封率较高的制剂，因此选择1.8%(w/v)作为处方中大豆磷脂的用量。第二章阿奇霉素亚微乳滴眼液的处方设计及制备工艺研究文献报道仅用磷脂作为乳化剂是不能对高压均质时形成的新的油水界面进行充分、迅速乳化的。因此，通常使用混合乳化剂形成复合凝聚膜，以增加乳剂的稳定性。泊洛沙姆188(F-68)和聚山梨酯80(Tween-80)作为乳化剂各有其优势。泊洛沙姆(Poloxamer)的国外商品名为普朗尼克(Pronic),是聚氧乙烯一聚氧丙烯嵌段共聚物类化合物。泊洛沙姆是优良的非离子型乳化剂，其具有安全性、无抗原性、无致敏性、无刺激性、不溶血等优良特性24],是目前常用的合成乳化剂，其中最常用的是泊洛沙姆188(F-68)。许多研究显示，泊洛沙姆188(F-68)与磷脂作为混合乳化剂能显著提高亚微乳剂的稳定性25,26,其主要机理是：泊洛沙姆188(F-68)中的高分子链自由舒展，可在油水界面与磷脂形成复合凝聚膜，增加了界面膜的柔韧性，使乳剂更为稳定[27,同时泊洛沙姆188(F-68)中亲水性良好的聚氧乙烯链可部分吸附在乳滴表面，自由舒展，向水相延伸，使乳滴难以相互靠近，从而产生较大的空间位阻；当乳滴突破位阻继续靠近时，高分子链被压缩而缠绕纠结，舒展性减小，熵值下降，抑制乳滴的进一步靠近和合并。因此泊洛沙姆188(F-68)和磷脂混合作为乳化剂，应更加有利于乳剂的稳定。聚山梨酯80(Tween-80)是一种非离子型表面活性剂，可用作乳化剂、分散剂、增溶剂或稳定剂等，广泛应用于药物、食品等，其用量从不足1%到12%不等。国外对聚山梨酯80(Tween-80)的安全性进行了深入的研究，已经积累了大量的资料，聚山梨酯80(Tween-80)已经在大量的经口途径或非消化道途径的药物制剂中应用，对其安全性亦进行了较为深入的研究。研究结果显示聚山梨酯80(Tween-80)具有较宽的安全窗，且对热稳定，低浓度时在水中形成胶束，其增溶作用不受溶液pH值的影响，高浓度时可出现液晶态结构。本实验以物理外观、粒径及粒度分布作为评价指标，对不同泊洛沙姆188(F-68)和聚山梨酯80(Tween-80)的用量进行了考察，实验结果见表2-3。IⅡⅢ①由处方I、Ⅱ、Ⅲ、IV四者比较可以看出，在一定程度上随着乳化剂总量增加，在