一种快速测定酱油和醋中对羟基苯甲酸酯的方法

一种快速测定酱油和醋中对羟基苯甲酸酯的方法对羟基苯甲酸酯又称羟苯甲酯或尼泊金酯，因其存在酚羟基结构，可破坏细胞膜，使细胞内的蛋微生物的酶系统活性，造成微生物的新陈代谢白色、无味，不会影响产品的色泽和风味，在人本东京都卫生研究所报道，即使微量摄入对羟基苯甲酸丁酯，也会造成实验大鼠精子数量和浓度的显鼠生殖系统造成不良影响[4];2008年，DARBRE等[5]的研究发现，对羟基苯甲酸酯具有雌激素和抗雄激素活性，不仅会影响男性生殖功能，还有可能增加乳腺癌的发病率；2012年，SUGANDH女性患乳腺癌的风险。对羟基苯甲酸酯的激素活性被越来越多的人所重视，在食品工业中的应用也受到了一定的限制。目前，我国要求酱油、醋中对羟基苯甲酸酯类及其钠盐(以对羟基苯甲酸计)最大使用量均为0.25g-kg-1[7],食样品前处理方法，该方法前处理工作操作简单1.1材料与试剂4种对羟基苯甲酸酯类混合标准溶液(1000mg·L-1):购自国家标物中心；乙酸乙酯：HPLC级，德国Merk公1.3方法饱和NaCl的饱和NaHCO3溶液：在饱和NaHCO3溶1.3.2样品前处理称取5g(精确至0.001g)均匀样品于50mL离心管中，加入10mL乙酸乙酯，振摇3min后，5000r·min-1离心5min,取上清液于新的50mL离心管中，加入10mL饱和NaCI的饱和NaHCO3溶液，振摇3min后，50001.3.3色谱条件进样口温度：250℃;进样模式：不分流；进样体积：1μL。程序升温：100℃保持1min;20℃min-1升温至170℃;12℃·min-1升温至220℃,保持1min;10℃·min-1升温至250℃,保持8min。2.1盐酸酸化步骤的去除在样品前处理过程中加入1:1盐酸1mL对样品进行酸化，可以将对羟基苯甲酸的钠盐酸化为对羟基苯甲酸，但是对羟基苯甲酸的沸点为336.2℃,不易被汽化，需经甲酯化后方能使用气相色谱法由于对羟基苯甲酸的酸度比碳酸强，使用饱和碳酸氢钠洗对羟基苯甲酸钠盐，因此原方法中加入1:1盐酸1mL对样品进行酸化，对检测结果无影响。本文使用含有对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯的酱油样品就是否需要酸化样品进行了6个平行样的对比，结果如表1所示。在样品前处理过程中加入1:1盐酸对样品酸化和不进行酸化，测定结果无显著差异。另外，考虑到节俭、环保的要求，本文方2.2萃取试剂的选择在实验用水和18%的NaCl溶液(模拟酱油的含盐量)中加入终浓度均为10mg·L-1的4种对羟基苯甲酸酯类，按1.3.2的操作经离心、氮吹、复溶、过膜后测定，结果如图1所示，用乙醚和乙酸乙酯提取实验用水中的对羟基苯甲酸酯类，上机检测，采用乙酸乙酯萃取时，4种对羟基苯甲酸酯的加标回收率基本在105%左右，明显优于乙醚；用乙醚、乙酸乙酯和乙腈提取18%NaCI溶液中的对羟基苯甲酸酯类，使用乙酸乙酯萃取时，4种对羟基苯甲酸酯的加标回收率基本在100%～105%,整体上优于乙醚和乙腈。因此，最终选择乙酸乙酯作为萃取试剂。乙酸乙酯提取18%NaCl溶液中对羟基苯甲酸酯类的回收率相对提取实验用水的回收率偏低，可能是由于乙酸乙酯在实验用水和18%NaCI溶液中的溶解度不同，溶于实验用水中的乙酸乙酯相对NaCl溶液更多一些，造成乙酸乙酯2.3净化溶剂的选择在5g酱油样品中加入10mg4种对羟基苯甲酸酯的标准物质，使用乙酸乙酯提取，分别采用20mL10g·L-1的NaHCO3溶液、20mL饱和NaCl溶液、10mL饱和NaCI溶液+10mL10g-L-1NaHCO3溶液、10mL的NaHCO3溶液、10mL饱和NaCl溶液、5mL饱和NaCI溶液+5mL10g-L-1NaHCO3溶液对提取液进行净化。实验过程中发现，提取液经含有NaHCO3的溶液净化后，有机层中的深色杂质会转移至水相中；若净化液中无NaHCO3,深颜色的杂质仍留存在有机层中，说明NaHCO3对提取液中的深色杂质含有NaHCO3。净化后的有机层，按1.3.2的操作氮吹、复溶、过膜后测定，结果如图2所示。使用20mL10g-L-1的NaHCO3溶液净化提取液后，4种对羟基苯甲酸酯的加标回收率大多高于110%,对羟基苯甲酸乙酯的加标回收率的NaHCO3溶液净化，净化溶液浓度相同，加入的体积不同导致加标回收率明显差异，再次验证了乙酸乙酯在水溶液中的溶解量增加，会导致加标回收率的上升。同理，对比20mL饱和NaCI溶液和10mL饱和NaCl溶液净化后的加标回收率，对比10mL饱和NaCl溶液+10mL10g·L-1NaHCO3溶液和5mL饱和NaCl溶液+5mL10g-L-1NaHCO3图2不同净化溶液的对羟基苯甲酸酯类回收率图前期的实验已经证明NaHCO3对去除提取液中杂质具有重要的作用，而且净化溶液的使用量会影响实验的最终结溶液，饱和NaHCO3的饱和NaCl溶液，饱和NaCl的10g·L-1NaHCO3溶液的净化效果。分别取10mL净化溶液净化10mL提取液，提取液中的深色杂质都能转移至水相中。通过图3的加标回收率比较，采用饱和NaCI的饱和NaHCO3溶液净化后，4种对羟基苯甲酸酯的综合回收率相对更优。2.5讨论图3不同净化溶液的对羟基苯甲酸酯类回收率图mg·L-1和300mg-L-1进行测试，分别以4种对羟基苯甲酸酯类的峰面积A为纵坐标，以质量浓度p(mg·L-1)为横坐标绘制标准曲线，详见表2。表24种目标物的线性关系、相关系数表在未检出对羟基苯甲酸酯类的酱油样品和醋样品中，分别添加6平行的0.6mg-kg-1(GB5009.31—2016的检出4种目标物在不同添加水平的回收率基本在70%～120%,相对标准偏差在0.90%~7.06%,表明该方法的准确度和精密度均较好。按照国标方法检出限水平添加，表3方法回收率和精密度实验表(n=6)本文样品前处理方法可以准确、快速高效、经济环保地测定酱油、醋中的对羟基苯甲酸酯类，时间约30min,批量样品的前处理时间与单个样品