基因芯片技术课件

1生物芯片简介及分类2基因芯片制备及应用第一节生物芯片简介及分类

二、生物芯片的分类微矩阵芯片：将用PCR或化学合成等方法得到的DNA或寡核苷酸片段用针点或喷点方法直接排列到玻片等载体，从而制备成芯片。特点是密度高、制作方便。电定位芯片：是利用静电吸附的原理将DNA快速定位在硅基质、导电玻璃上，从而制备成芯片。特点是在电力推动下可使杂交快速进行，但制作工艺复杂，点样密度低。基因芯片杂交结果图蛋白质芯片(proteinchip):就是选择一种能够牢固地结合蛋白质分子(抗原或抗体)的固相载体，在上面按预先设计的方式固定大量蛋白质(抗原或抗体)，形成蛋白质的微阵列，然后加入与之特异性结合的带有特殊标记的蛋白质分子(抗原或抗体)，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检。(四)按芯片的使用功能分类测序芯片、表达谱芯片、基因差异表达分析芯片第二节基因芯片制作及应用二、基因芯片的基本原理基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray三、基因芯片的制备ComparisonofDNAChipTechnology

Oligo-Chip cDNA-Chip GenomicChip8nor20n<2,000n>50,000n

sequencingexpressionexpressiongenomicanalysis（一）芯片的制备基因芯片种类较多，主要以玻璃片、硝酸纤维素膜或硅片为载体，制备方法基本上可分为两大类－原位合成和预合成后点样。预合成后点样：是指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经合成好，点样系统需要做的就是把这些合成好的样品涂在基体上。原位合成：是指利用光导合成的方法在载体表面上逐个合成寡核苷酸，合成后点样可能将十几至几十个碱基的寡核苷酸或几百个碱基的cDNA片段固定到载体上制成寡核苷酸芯片或cDNA微阵列。1支持物的预处理载体材料要求：载体表面必须具有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联。使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量。载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机械的、物理的和化学的稳定性。惰性:是指载体的其他性能或特异性吸附都不应该干扰生物分子的功能。稳定性:是指在进行分子杂交或结合时，可能遭受一定的压力或酸、碱条件而不发生变化。支持物的预处理实性材料：硅芯片、玻片和瓷片,需进行预处理,使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜,通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。2芯片的制作目前常用的基因芯片制作方法：接触点样法、喷墨法、原位合成法。接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器，可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。喷墨法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。在1cm2面积上可喷射10000个点。（二）样品的准备样品的分离纯化：DNA,mRNA扩增：PCR,RT—PCR，固相PCR探针的标记：已克隆的基因片段、PCR，RT-PCR扩增的基因片段、人工合成的DNA片段，单链、双链、DNA或RNA均可作为探针。荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性标记,通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对探针的标记。对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片,一般需要从细胞和组织中提取RNA,进行逆转录,并加入偶联有标记物的dNTP,从而完成对探针的标记过程。

探针的固化：打印探针后，需要将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非特异性固定。(三)分子杂交该反应是指标记的样品与芯片上的靶基因进行杂交，产生检测信号的过程。

与经典分子杂交的区别：杂交时间短，30分钟内完成,可同时平行检测许多基因序列。影响杂交反应的因素：靶分子的浓度、探针浓度、靶分子和探针的序列组成、盐浓度、杂交温度和反应时间、DNA二级结构等。(四)信号检测与结果分析芯片经杂交反应后，各反应点形成强弱不同的光信号图像，用芯片扫描仪和相关软件加以分析，即可获得有关的生物信息。如果是用同位素标记靶基因，其后的信号检测即是放射自显影；若用荧光标记，则需要一套荧光扫描及分析系统，对相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较，得到待测样品的相应信息。基因芯片扫描结果不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红〉黄〉绿〉兰〉紫信号检测与结果分析激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号软件进行进行图象分析和数据处理

GenomicDNA四、基因芯片的特点五、基因芯片的应用进一步阐明基因的相互协同、抑制、互为因果等关系。有助于理解基因及其编码的蛋白质的生物学功能，并从已知生物学功能的基因推论未报道基因的生物学意义。同时，还可在基因水平上解释疾病的发病机理，为疾病诊断、药效跟踪、用药选择等提供有效手段。急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表达谱芯片的研究。基因型及多态性分析：利用结合在玻璃支持物上的等位基因特异性寡核苷酸(ASOs)微阵列建立了简单快速的基因多态性分析方法。将ASOs共价固定于玻璃载片上，采用PCR扩增基因组DNA，其一条引物用荧光素标记，另一条引物用生物素标记，分离两条互补的DNA链，将荧光素标记DNA链与微阵列杂交，通过荧光扫描检测杂交模式，即可测定PCR产物存在的多种多态性，该方法对人的酪氨酸酶基因第4个外显子内含有的5个单碱基突变进行分析，结果显示单碱基错配与完全匹配的杂交模式非常易于区别。这种方法可快速、定量地获得基因信息。基因芯片测序流程疾病的诊断与治疗：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病和肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比，它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测；无需机体免疫应答反应，能及早诊断，待测样品用量小；能检测病原微生物的耐药性，病原微生物的亚型；极高的灵敏度和可靠性；检测成本低，自动化程度高，利于大规模推广应用。这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。

在环境科学领域中的应用：在环境保护上，基因芯片也广泛的用途，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。

本章重点掌握的内容第一节、基因芯片一、什么是基因芯片（Genechip）

1、

所谓基因芯片是指将大量探针以很的高密度分子固定于支持物上，然后与标记的核酸样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量，也可还可以用于核酸样品的序列分析。

基因芯片杂交结果图常用的待测分子PCR产物：序列分析RT-PCR产物：基因表达分析基因芯片使用步骤芯片制作把探针固定于载体表面样品处理目标分子富集分子间的杂交结果检测与数据分析第二节、基因芯片的制作基因芯片的制作方式原位合成直接点样光引导原位合成分子印章法分子印章法针式点样喷墨点样一、针式点样1、玻璃片基的处理：使玻璃表面获得羟基、醛基、氨基等活性基团。2、点样针沾取探针溶液。3、点样针把探针点到玻片表面，让探针末端的化学集团与玻片表面的集团形成共价键。4、针式点样的优缺点优点：成本低，操作简单，密度高（几千-几十万点/cm2)，转移过程中探针溶液损失小。缺点：定量准确性、重现性不好2202芯片点样仪

生产商Bio-Rad

性能介绍分辨率：1.25um(x，y轴)和0.25um(Z轴)，重复性：3um

球面精确性：l0um。

一次制成芯片数：126块芯片每块玻片点样量>82,000个点

二、喷墨点样喷墨点样的方式类似于喷墨打印机。将合成用探针溶液放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的探针试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。第三节、基因芯片的使用流程以HLA基因多态性为例一、待测分子的获得与标记

1）提取患者基因组DNA

2）DNA样品PCR扩增并进行标记。常用标记物为荧光素。1.末端标记：在引物上标记有荧光素，在DNA扩增过程时，使新形成的DNA链末端带有荧光素。

2.随机插入：选择四种缄机基，使其中一种或几种挂有荧光素，在PCR过程中，带有荧光素的碱基和不带荧光探针的碱基，同时参与DNA链的形成。二、杂交过程类似于一般的杂交法。把要杂交的分子的溶液覆盖芯片的探针，用盖玻片覆盖，即可杂交。杂交温度的选择极关键。芯片杂交炉

（Hybridizationoven)

生产商Affymetrix

全自动控制芯片的杂交过程。温度控制精确，芯片舱的转动提供充分的混合。该杂交炉可以同时处理64张芯片。

三、基因芯片的扫描

基因芯片杂交结果要用专用的扫描系统读取。BBACDE放大器数模转换器计算机A:激光器B:滤光片C:二色镜D:反光镜E:关栅

ScannerArrayScannerArray扫描仪采用氩离子激光器来激发与目的DNA结合的荧光分子来产生定量的杂交信号。ScannerArray扫描仪扫描芯片上成千上万的探针。扫描的同时给出高分辨率的实时的图像，同时荧光亮度的数据储存在原始文件中。激光源:

488nm氩离子激光器

激光束直径：3微米

检测指标：

样品点直径：20微米

支持的染料：荧光素

分辨率：3微米

预扫描时间：最长2分单次扫描时间：最长4分钟（12.8mmx12.8mm）基因芯片扫描结果不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红〉黄〉绿〉兰〉紫四、结果分析当从芯片发出的荧光转换成数字输出后，数据文件就被定量和翻译，通过重叠芯片像线栅，软件对芯片上的每个点计算平均密度值，从而完成定量，通过对芯片上实验点和对照点的比较，选出杂交点，并定量。

GenomicDNA基因芯片具有什么优点与缺点？4、生物芯片的优点1）高通量性：可同时并行分析成千上万种分子。节省时间。2）微型化，实验所需试剂用量少3）高度自动化5、缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不同。生物芯片于一般分子杂交比较生物芯片Southern等信息通量高，几千-几十万点/cm2低自动化程度高低研究的速度快慢实验结果的平行性好低第四节、基因芯片在医学领域的应用一、基