（高清版）DB12∕T 505-2014 玉米转基因成分筛查方法　

DB12DB12/T505—2014玉米转基因成分筛查方法Screeningmethodforgeneticallymodifiedmaize2014-04-22发布2014-07-20实施天津市质量技术监督局发布本标准2014年04月首次发布。本标准规定了玉米中转基因成分定性PCR筛查的术语本标准适用玉米及其制品中zSSIIb基因、HPT基因的定性PCR筛查检测GB/T6682分析实验室用水规格NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品检测抽样zSSIIb基因zSSIIbgeneCaMV35S启动子35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus（CaMV）NOS终止子terminatorofnopalinesynthase（NOS）geneBt基因Bt（Bacillusthuringiensis）gene来源与苏云金芽胞杆菌（Bacillusthur），见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/crybar基因bialaphosresistanceacetyltransferase，PHPT基因HPTgene来源于大肠杆菌或链球菌（Streptomyceshygroscopicus编码潮霉素磷酸转移酶（hygromycin4检测方法4.1.1实验用水为重蒸馏水或符合GB/），注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴），）：）：），），4.1.9加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯腈蓝，用10mL水溶解；称取50.04.1.13引物：玉米内标准基因和转基因玉米zSSIIbCaMV35SNOSBtbarbar-F：5′-GAAGGCACGCAACGCCTAbar-R：5′-CCAGAAACCCACGTCATGC262bpHPThpt-F：5′-GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT-hpt-R：5′-AGATGTTGGCGACCTCGTA472bp按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定的执行。按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定的执行。水2.5µL25mmol/L氯化镁溶液2.0µL0.25～1.25µL0.25～1.25µL0.025U/µL2.0µL25.0µL测反应体系中，上、下游引物分别是bar-F和bar-R，引物终浓度分别为0.2µmol/L；HPT基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别是hpt-F和hpt-R，引物终浓度分别为0.zSSIIbNOSBtbarHPT4.3.5.1.5反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与4.3.5.1相同。mL琼脂糖溶液中加入5µLEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12µLPCR产物与3µL加样缓冲液条件下电泳检测。扩增片段是否为目的DNA片段，按照4.3.8和4.3.9的规定执行。将回收的PCR产物克隆测序，与玉米内标准基因zSSIIb、5.2.1在试样的PCR反应中，内标准基因得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致；而CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、bar基因和HPT基因均未得到扩增，或扩增片段大小与预A.2CaMV35S启动子PCR扩增产物核苷酸序列