2025届高考生物一轮复习：高中生物PCR技术中“引物”相关问题归类分析

高中生物PCR技术中“引物”相关问题归类分析近几年高考试题和模拟题中出现了大量与引物有关的试题，而现有高中生物教材只提及PCR技术需要引物。为什么需要引物？引物是什么？引物的作用是什么？引物的碱基序列如何设计？PCR循环时需要几种多少个引物？如何选择引物和判断引物的互补链？引物与PCR反应时复性温度的高低和时间长短有什么关系？这些相关问题在教材中并没有提及，因此需要教师对上述相关问题进行归类分析。笔者在基因工程专题的复习过程中建构了以引物为核心的知识网络图（图1），培养学生学科内知识的综合能力，拓展学生视野，提高学生的科学素养。然后各个击破相关知识点，夯实学生的基础，加深对引物的理解。利用精选的典型试题，强化巩固知识，提升学生的解题能力。同时从侧面为教师的教学提供参考，提升对教学的广度和深度的把控引物引物引物的选择和引物互补链的判断PCR循环时引物的计算引物的设计原则引物的处理引物与PCR反应时复性温度的高低和时间长短之间的关系DNA的复制和PCR反应需要引物引物的设计引物的作用图1“引物”知识网络图1引物存在的必要性1.1DNA的复制需要引物DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加到已有核酸链的游离3′-羟基上，而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合，也就是说，它需要引物链的存在[1]。引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基互补配对。细胞内DNA复制以RNA作引物，从新合成的冈崎片段上发现含有一短暂存在的小的RNA片段附着在5′段这一事实可以说明DNA复制时需要RNA引物，这些引物长5-10bp，现在已经知道RNA引物的合成是由一种特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的[2]。PCR反应以DNA作引物。例1：请回答基因工程方面的有关问题：PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式（图2）不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为。图2DNA聚合酶催化的反应的表达式1.2引物的作用DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。不同的引物可以寻找不同的目的基因并进行扩增。例2：请回答基因工程方面的有关问题：1）若用PCR技术扩增psy基因和crtI基因，需要分别在不同的PCR扩增仪中加入种引物，其作用是。2）在利用PCR技术扩增R（抗旱）或r基因过程中，利用_____可寻找抗旱基因的位置并进行扩增。例3：为研究水稻D基因的功能，研究者将T-DNA插入到D基因中（图3），致使该基因失活，失活后的基因记为d。为验证F2植株基因型（DD、Dd和dd），研究者根据D基因、T-DNA的序列，设计了3种引物，如图4所示：图3将T-DNA插入到D基因图43种引物的碱基序列随机选取F2植株若干，提取各植株的总DNA，分别用引物“Ⅰ+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR）。如果引物“Ⅰ+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR均可完成扩增，则相应植株的基因型为。如果，则相应植株的基因型为。如果，则相应植株的基因型为。2引物的设计2.1引物的设计原则引物是根据目的基因特有的一段已知的核苷酸序列设计合成的，能与目的基因的模板链通过碱基互补配对特异性地结合。设计引物的主要原则为[1]：①引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合。②引物与靶序列间的Tm不应过低。③引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列。④两引物间不应有4bp以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补的碱基。⑤引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%。例4：请回答基因工程方面的有关问题：1）通过PCR技术可在DNA分子中专一性扩增出某目的基因，其原因是。2）请回答基因工程方面的有关问题：设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（图5）都不合理，请分别说明理由。图5设计的两组引物部分碱基序列①第1组：；②第2组：。3）科研过程中，可以用PCR技术检测受体细胞是否成功转入了目的基因。提取转染后的细胞的全部DNA分子，用目的基因的引物扩增。扩增完毕后，检测发现扩增产物中除目的基因外，还有其他不同大小片段的非目的基因片段，可能的原因一般有。①模板受到污染②退火温度过高③引物太短④延伸温度偏低2.2引物的处理由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此可以给予修饰而不影响扩增特异性。引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等[3]。为了使经PCR扩增的目的基因能与运载体正常结合，需要在两种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。在两种引物的5′端上添加不同的限制酶识别序列，是为了保证目的基因定向插入运载体并可避免目的基因自身环化。例5：为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备α-淀粉酶。为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的____端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是。2.3引物的特点综合2.1和2.2可知，引物具有以下几个特点：①引物能与DNA母链通过碱基互补配对结合；②两种引物之间不能互补配对；③某一引物不能自身折叠出现局部碱基互补配对；④需要在两种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列；⑤引物不能太短。3PCR循环时与引物相关的计算PCR的原理是DNA分子的半保留复制，所以要根据DNA分子的两条模板链设计两种引物。PCR循环时需要的引物数量的计算有两种方法，方法一：第n次循环产生的DNA数为2n，根据DNA分子的半保留复制可知，需要的引物数为2n个，从第1次循环开始，需要引物的个数依次为2个、22个、23个……2n个，故PCR过程经过n次循环，需要的引物总个数是2+22+23+……+2n=2n+1-2。方法二：PCR经过n次循环产生的DNA数为2n，一共有2n+1条链，其中有两条链是DNA母链，不含引物，其它的每一条链都含一个引物且两种引物的数量相等，故PCR过程经过n次循环，需要的引物总个数是2n+1-2，需要某一种引物的总个数是（2n+1-2）×1/2=2n-1。2n个DNA中，1个DNA由一条母链和第一种引物延伸的子链组成，另1个DNA由另一条母链和第二种引物延伸的子链组成，其它的DNA都由两种引物延伸的两条子链组成。例6：通过PCR方法获得某目的基因，首先需要设计______（填“一对”或“一个”）引物，PCR过程经过4次循环，第4次循环时需要的引物的数量是个，4次循环一共需要的引物的总数量是个。例7：请回答基因工程方面的有关问题：利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图6所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。图6PCR的原理示意图①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为。②在第轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。4引物的选择和互补链的判断DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，引物5′端的碱基与DNA母链3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，DNA子链的合成方向是从引物的为5′向3′延伸。可利用这一特点来判断引物以及引物的互补链。例8：为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图7中的。图7引物组成图例9：下图是为了扩增某目的基因所用引物的分布示意图（图8），已知引物组合1和2、3和4可扩增相关的目的基因，则引物1、3与（填α链或β链）形成碱基互补配对关系。图8引物的分布示意图5引物与PCR反应时复性温度高低的关系PCR的每次循环可以分为变性（90～95℃）、复性（55～60℃）和延伸（70～75℃）三步。变性的温度与目的基因中G+C含量有关；变性时间一般为30-60s，足以使模板DNA完全变性。复性是让两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA模板结合，如果复性温度太高，引物不能与模板很好地结合，扩增效率将会非常低；选择较高的复性温度可以提高PCR的特异性，如果复性温度太低，引物的3′端将与模板产生非特异性结合，从而导致非特异性DNA片段的扩增。复性的温度与引物中G+C含量有关，G-C碱基对间有三个氢键，A-T碱基对间只有两个氢键，引物中G+C含量较高，复性时温度就较高。复性时间一般为30-60s，足以使引物与模板之间完全结合。延伸的温度不能太高，以防止新合成的子链DNA与母链DNA解聚为单链，延伸的温度也不能太低，是为了保证Taq酶的活性；延伸所需要的时间长短与目的基因的长短有关，目的基因越长，延伸所需要的时间就越长。例10：将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图9为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。表1引物对序列表引物对AP1AACTGAAATGTAGCTATCP2TTAAGTCCATTACTCTAG引物对BS1GTCCGACTAGTGGCTGTGS2AGCTGGCGTTTAGCCTCG图9引物对与模板结合示意图例11：请回答PCR扩增时与退火温度、延伸温度和延伸时间有关的问题：1）进行PCR扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中的设定与引物有关，的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）①变性温度②退火温度③延伸温度④变性时间⑤退火时间⑥延伸时间2）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但的引物需要设定更高的退火温度。3）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有（填序号）。=1\*GB3①升高退火温度 =2\*GB3②降低退火温度 =3\*GB3③重新设计引物4）通过PCR方法获得eGFP目的片段，首先需要设计（填“一对”或“一个”）引物，在体外选择性扩增eGFP目的片段。PCR反应一般由95℃热变性、55～60℃引物和模板配对、72℃延伸三个步骤，经过多次循环完成。延伸阶段选用72℃是综合考虑了两个因素，这两个因素是和。例12：某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施有效的是()A．增加模板DNA量B．延长热变