超高效液相色谱法检测大豆异黄酮含量

大豆异黄酮（CatheRineGenistein）是黄酮类化合物的一种，它作为一种次生代谢产物，形成于大豆植物体生长过程。大豆异黄酮结构与雌激素相似，因此又称植物雌激素[1]。大豆异黄酮不仅具有明显的抗氧化作用，而且还可以起到预防骨质疏松、多种癌症、心血管疾病等功效[2]。大豆异黄酮母核为3-苯并吡喃酮，以游离型的苷元和结合型的糖苷形式存在[3]。糖苷占大豆异黄酮总量的97%～98%，苷元仅占大豆异黄酮总量的2%～3%。糖苷主要有大豆苷（daidzin）、料木苷（genistin），苷元主要有染料木素（genistein）、大豆苷元（daidzein）[4]。目前，紫外吸收法、气相色谱法、高效液相色谱法等[5-7]是大豆异黄酮的主要检测方法。其中，紫外吸收法灵敏度不高，只能测定大豆异黄酮总量。气相色谱法前处理复杂，需要对异黄酮进行衍生。高效液相色谱法具有样品分离度好、定量准确、操作容易、处理简单等优点[6]。因此，本文建立一种超高效液相色谱法，用于测定大豆中大豆异黄酮含量，以提供一种快速简便、灵敏度高的大豆异黄酮含量检测方法。1材料与方法1.1材料与试剂大豆（市购），粉碎备用。大豆苷（daidzin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）、染料木苷（genistin）（纯度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈，Merck公司，为色谱纯；乙酸，Merck公司，为分析纯；超纯水，一级水。1.2仪器与设备ACQUITYUltraPerformanceLC超高效液相色谱仪，Waters公司；2998PhotodiodeArrayDetector光电二极管阵列检测器，Waters公司；涡旋混合器，IKA公司；超声波仪，宁波东和超声波科技有限公司；恒温干燥箱，上海宏泰仪器设备厂；高速离心机，HITACHI公司；分析天平，OHAUS公司；PURELABChorus超纯水机，ELGA公司。1.3试验方法1.3.1标准工作液配制标准储备液：用分析天平准确称取大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷0.01g，置于100mL容量瓶中，加入70%甲醇溶解，并定容至刻度，制成0.1mg·mL-1标准储备液。标准工作液：临用时，根据实际需要，对标准储备液用进行适当的浓度稀释，得到标准工作液，保存于冰箱中备用。1.3.2样品处理用分析天平准确称取试样10g，精确到0.01g，将试样置于100mL离心管中。加入70%甲醇定容，涡旋混合60s，超声波仪中振荡20min，然后放入离心机内，在离心机中以9000r·min-1离心5min，取离心上清液，移至100mL容量瓶中。用0.45μm滤膜过滤，加入70%甲醇补至相应刻度。吸取10mL样品，将其置于100mL离心管中，恒温干燥箱浓缩至干，用乙腈-0.2%乙酸溶液将浓缩样品定容至5mL，再用0.45μm滤膜过滤，移至进样瓶中。1.3.3色谱条件色谱柱为WatersACQUITYUPLCBEHCC18柱[8]（150mm×2.1mm，1.7μm），进样量为5μL；流速为0.15mL·min-1；经全波长扫描大豆异黄酮成分，并比较了不同波长的峰，结果发现，在260nm波长处灵敏度高，因此检测波长选择260nm；大豆异黄酮的保留值和分离度都受柱温的影响，为了避免柱温较高，缩短保留时间，选择30℃柱温；由于大豆异黄酮极性较弱，为实现完全分离，通过研究乙腈和不同浓度的乙酸对大豆异黄酮成分保留值和分离度的影响，流动相选用乙腈-0.2%乙酸，梯度洗脱条件如表1所示。表1分离梯度程序表2结果与分析2.1线性关系及检出限吸取一定量的大豆异黄酮标准工作液，用甲醇水溶液将其稀释成1.0μg·mL-1、3.0μg·mL-1、5.0μg·mL-1、7.0μg·mL-1、9.0μg·mL-1以及0μg·mL-1的溶液，经处理后进行测定，每个大豆异黄酮成分重复测定3次。设定浓度为横坐标X，大豆异黄酮成分3次测定峰面积平均值为纵坐标Y，对其进行线性回归，得到大豆异黄酮成分的标准曲线，如表2所示。线性检测范围均为1.0～9.0μg·mL-1。表2大豆异黄酮成分标准曲线表2.2精密度试验分别精密吸取同一标准工作液，连续平行进样5次，测定4种大豆异黄酮成分的峰面积，如表3所示。大豆苷的RSD为0.28%，大豆苷元的RSD为0.22%，染料木素的RSD为0.32%，染料木苷的RSD为0.26%，结果表明仪器精密度良好。表3大豆异黄酮成分精密度表2.3稳定性试验在样品溶液中，加入标准工作液，每隔4h进一次样，进样6次，测定4种大豆异黄酮成分的峰面积，如表4所示。大豆苷的RSD为0.33%，大豆苷元的RSD为0.25%，染料木素的RSD为0.88%，染料木苷的RSD为0.46%，结果表明，标准工作液在24h内稳定。表4大豆异黄酮成分稳定性表2.4回收率试验回收试验时，在样品溶液中，准确加入大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷的标准工作液，重复进样5次，得到4种大豆异黄酮成分的回收率，如表5所示。结果表明，大豆苷回收率为97.6%，RSD为1.8%；大豆苷元回收率为98.2%，RSD为1.7%；染料木素回收率为98.6%，RSD为2.1%；染料木苷回收率为97.6%，RSD为1.4%。表5大豆异黄酮成分回收率表2.5样品测定精确吸取样品溶液5μL，对大豆异黄酮含量进行检测，计算得出大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷含量，具体如表6所示。表64种大豆异黄酮含量表3结论大豆异黄酮在我国药品、保健品、食品等行业应用广泛，为满足日常大豆异黄酮检测的需求。通过试验建立了一种超高效液相色谱法检测方法，用于测定大豆中大豆异黄酮的含量，该超高效液相色谱法采用BEHCC18色谱柱，能够在较大的样品流量下，保证色谱柱的柱效，实现快速分离，并保证峰形尖