职业教育医学生物技术专业教学三下一代DNA测序技术二第一代

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三、下一代DNA测序技术

二、第一代DNA测序技术一、基本原理本章概要DNA的测序技术

四、第三代DNA测序技术职业教育医学生物技术专业教学资源库PacBioSMRT测序技术纳米孔单分子测序技术0102第三代DNA测序技术第三代基因测序技术PacBioSMRT技术纳米孔单分子测序技术基因测序第一代基因测序：Sanger测序采用的是直接测序法，Sanger测序目的是寻找与疾病有关的特定的基因突变。但是对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，而且其只能在PCR扩增后测序。而且只能逐段测序，分析单个DNA片段。测序成本高，数据分析量大，自动化程度不高。另外，此法，速度慢，时间长。

第二代基因测序第二代测序技术测序平台和测序成本仍然十分高昂，仪器普遍高达40-70万美元，而一个全基因组测序至少需要2000-5000美元，同时花费几周的时间；第二代测序技术依赖于基因样品的扩增过程，大量的洗脱过程即增加了成本和样品制备的时间，也容易出现错误累积；第二代测序技术普遍读长为150-400bp，无法满足更高的科研需要；大量的数据拼接工作和光学读取导致的大体量数据，让分析变成了耗时耗力的工作。Better?PacBioSMRT测序技术PacificBiosciences公司研发的单分子实时测序系统（SingleMoleculeRealTime，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。技术创新：零模波导孔（zero-modewaveguides,ZMWs）荧光标记在核苷酸焦磷酸链上高性能光学捕获系统PacBioRS零模波导孔（zero-modewaveguides,ZMWs）ZMW，

是一个直径只有10~50nm的孔，包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。进行互补配对的dNTP停留在这个区域内的时间为ms，相比于它进入的时间us及未配对的dNTP进入和离开的时间长很多，因此，配对的碱基因其携带的荧光基团被激活发出较强荧光而被检测到。检测区内其它碱基因停留时间太短而荧光信号会很弱，未参入dNTP由于未进入检测区而未被激发出荧光信号，因此大幅地降低了背景荧光干扰。荧光标记在核苷酸上的磷酸基团上完全模拟体内DNA自然合成，在下一个dNTP被添加到合成连之前，这个dNTP的磷酸基团会被释放，荧光分子离开检测区从而可消除背景噪音。高性能光学捕获系统PacBioRSPacBioRS主要由一个大孔径物镜和四个单光子照相机来收集荧光所发射的光脉冲，使用一套优化的算法，将光学系统所捕获的信息翻译成ATGC碱基序列。PacBioSMRT测序原理1.

PacBioSMRT测序建库2.聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部3.4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部4.荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配5.荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光6.酶反应过程中，使dNTP上的荧光基团脱落，在酶的

作用下合成一个碱基7.统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列。纳米孔基因测序技术

纳米孔基因测序技术英国牛津纳米孔公司最新研发出第三代基因测序技术，这项新的基因测序技术采用纳米孔单分子读取技术工作原理对DNA进行生物或化学处理,而采用物理办法直接读出DNA序列.其原理可以简单的描述为:电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔。单个碱基通过纳米尺度的通道时,会引起通道电学性质的变化.理论上,A,C,G,T4种不同的碱基化学性质的差异会导致它们穿越纳米孔时引起的电学参数的变化量也不同,对这些变化进行检测可以得到相应碱基MinION的尺寸之小，只有一支笔的长度，重大约100克，MinION完全颠覆了测序仪的形象，MinION直接通过USB链接到笔记本上，原始的电流信号通过网络传到英国的服务器上，进行读取。一个MinION有500个纳米孔在并行测序，每个孔每秒测30bp，因此，要测到1G的数据，需要3天时间。

纳米孔生物纳米孔固体纳米孔前言：DNA链的直径非常小(双链DNA直径约为2nm,单链DNA直径约为1nm),所以对所采用的纳米孔的尺寸有着近乎苛刻的要求.纳米通道(nanopore)是1999年由美国加州大学的Deamer和哈佛大学的Brant组共同提出的，是指由7聚体的a溶血素(aHL)在双层脂膜上形成的直径在(1．5～2．6)nm通道。左膜通道最窄处直径尺寸约为1.5nm,恰好允许单链DNA分子通过,并且大小严格一致，从本质上说是一种离子通道．核酸外切酶附着在碱基表面将落入的孔的一侧的外表面，而让一种合成的环糊精作为传感器共价结合到纳米孔的内表面，将这个系统镶嵌在一个脂质双分子层内。为了提供既符合不同碱基检测又满足外切酶活性的物理条件，须事先将脂质双分子层，调为不同的盐浓度。在合适的电压下，核酸外切酶消化单链DNA，单个碱基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂作用，从而影响流过纳米孔的电流。

固态纳米孔主要是利用硅及其衍生物制造而成,一般使用离子束或电子束在硅或其他材料薄膜表面钻出纳米尺度的孔洞,再进一步对孔的形状和大小进行修饰而成.相比于生物纳米孔,固态纳米孔在稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显著的优势,但是因为受限于如今的半导体工艺制造水平,固态纳米孔的制造还较为复杂与昂贵.前提条件：（ⅰ)每个核苷酸都有其特有的电流阻塞信号;(ⅱ)纳米孔具有合适的几何尺寸,一次只容纳一个碱基通过;(ⅲ)电流分辨率足以检测核苷酸的移动;(ⅳ)核苷酸分子的运动必须是单向的;(ⅴ)纳米孔与薄膜之间的组合应当足够牢固以适应实验所需的温度和化学环境.薄膜将溶液分为2个区域,薄膜上的纳米孔作为连接2个区域的导电通道.在薄膜的两侧加上偏置电压,溶液中的离子在电压作用下经过纳米孔产生离子电流,在外部条件不变且无DNA分子通过纳米孔的情况下,该电流是稳定的.DNA分子在驱动电压作用下单向通过纳米孔通道时,在合适的电压下，核酸外切酶消化单链DNA，单个碱基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂作用。由于碱基阻塞了通道导致流经纳米孔通道的离子流量减小,因此可以观察到离子电流的减小.离子电流可以通过偏置电压乘以总电导的方式求得.腺嘌呤A与胸腺嘧啶T的电信号大小很接近，但T在环糊精停留的时间是其他核苷酸的2到3倍，鸟嘌呤G和胞嘧啶C各自停留的时间也不同，所以每个碱基都有特有的电流干扰振幅而区分开来。另外甲基化的c在环糊精的停留时间为正常c在环糊精的停留时间的两倍，所以通过纳米孔检测还可以直接读取甲基化的c

隧道电流对DNA分子经过电极时的位置、方向十分敏感,所以即使非常微小的差异也会引起隧道电流的变化,如何控制DNA分子准确、单一方向地通过纳米孔也很难。电容检测法作为一种可能的电学解决方案,也有研究者对此进行了研究,当单个碱基通过纳米孔时,其自身所带电荷会引起纳米电容上的电荷量发生变化,从而可以检测到电压的变化,理论上4种不同的碱基所带电荷不同,引起的电压变压也会有所差异,因此可以用于DNA的测序.实际在测量单个碱基过程中得到的电压值会受到DNA骨架、附近碱基和溶液离子的影响,因此在碱基识别的准确度上还有很多需要研究的问题.

电容检测法

荧光测序DNA序列信息转换成两种颜色的图形信息，然后再通过光学读出技术进行检测、分析。于是人们开发出了一种新的方法，使用合成DNA和光读取技术测序。待测DNA链中的每一个核苷酸都被替换成更长的由橙色和蓝色碱基组成的寡聚体，每一个待测核苷酸都被12bp的寡聚体替代。同时，通过这种信号转化还将DNA链中原本的四种信号A、T、G、C简化成了A、B两种信号。

缺陷

1，DNA高速通过纳米孔的特性使得高速测序成为可能，但同时这种高速度也正是很多纳米孔测序技术的弱点。因为速度太快，检测的信号质量就不高，甚至很多小的信号根本就检测不到。当DNA在电泳作用下通过纳米孔时，由于扩散作用的影响，降低了测序的质量。鉴于此，对于纳米孔测序技术来说，最为重要的一点就是如何控制并减慢DNA分子通过纳米孔的速度，同时尽量消除由于纳米孔表面相互作用给DNA分子跨孔动力学上造成的波动现象。降温和增加溶液的粘稠度可以在一定程度上减慢DNA分子通过纳米孔的速度，但这两种方法都不能消除因纳米孔表面相互作用造成的跨孔动力学波动现象。2，溶血素七聚体是最常用于在脂质双分子层中制造生物纳米孔的材料，它性质非常稳定。但脂质双分子层的性质却不那么稳定，尤其是液态脂质双分子层，制造起来极难且费时。金属氧化物等介质上“制作出”稳定的、有功能的固态纳米孔制作工艺非常繁琐，速度慢又耗费人力，而且制作出的产品还常常无法达到应用的要求。总结尽管离纳米测序完全投入商业化还有一段距离，但是我们可以预见，一旦其技术条件完全成熟，为人类的基因测序带来的改变是巨大的。纳米孔测序技术在成本、速度等方面有着十分巨大的优势