（高清版）DB12∕T 1359-2024水产养殖用非规范药品中喹诺酮类、磺胺类、酰胺醇类抗生素残留量的测定+液相色谱-质谱-质谱法-3

ICS65.150CCSB50DB12DB12/T1359—2024水产养殖用非规范药品中喹诺酮类、磺胺类酰胺醇类抗生素残留的测定液相色谱-质谱/质谱法Determinationofquinolones,sulfonamidesandamidolantibioticresiduesinnon-standarddrugsforaquaculturebyliquidchromatography-tandemmassspectrometry2024-11-27发布2025-01-01实施天津市市场监督管理委员会发布1DB12/T1359—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由天津市农业农村委提出并归口。本文件起草单位：天津市农业生态环境监测与农产品质量检测中心、山东省科学院海洋仪器仪表研本文件主要起草人：陈永平、成振华、王辉、韩现芹、时文博、史艳艳、高丽娜、王愿宁、高丽、李灏、曹建新、易伟、苏梦寒。DB12/T1359—20242水产养殖用非规范药品中喹诺酮类、磺胺类、酰胺醇类抗生素残留的测定液相色谱-质谱/质谱法本文件规定了水产养殖用非规范药品中喹诺酮类、磺胺类、酰胺醇类抗生素留量测定的原理、试剂和材料、仪器、分析步骤、结果计算、正确度与精密度。本文件适用于水产养殖用非规范药品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹噁啉、磺胺异噁唑、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考共17种抗生素残留量检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1非规范药品non-standarddrugs水产养殖过程中用来净化水质、改良地质、除杂等的非药品，包括水质改良剂、底质改良剂、微生态制剂、除杂剂及促生长剂等。非规范药品中喹诺酮类、磺胺类、酰胺醇类抗生素，先加水溶解或稀释，再用酸化乙腈萃取，经固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱法检测，内标法定量。5试剂材料除非另有说明，水为GB/T6682规定的一级水。5.1.1甲醇(CH₃OH,CAS号：67-56-1):色谱纯。5.1.2乙腈(CH₃CN,CAS号：75-05-8):色谱纯。5.1.3甲酸(HCOOH,CAS号：64-18-6):色谱纯。3DB12/T1359—20245.1.4二氯甲烷(CH₂Cl₂,CAS号：75-09-2):分析纯。5.1.5乙酸乙酯(C4H₈O₂,CAS号：141-78-6):分析纯。5.1.6氯化钠(NaCl,CAS号：7647-14-5):分析纯。5.1.7乙酸铵(CH₃COONH₄,CAS号：631-61-8):分析纯。5.2溶液配制5.2.1乙酸铵(2.0mmoL/L)-甲酸溶液(0.1%):称取0.077g无水乙酸铵，用0.1%甲酸水溶液溶解并稀释至500mL。5.2.2甲醇-水溶液(15+85,体积比):量取甲醇15mL加入85mL水中，混匀。5.2.3甲酸-乙腈(0.1+99.9,体积比):量取甲酸0.5mL,加乙腈稀释至500mL,混匀。5.3标准品17种抗生素类标准品应符合附录A,纯度≥95%。5.4标准溶液配制5.4.1标准贮备液100μg/mL。取诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺多辛、磺胺喹恶啉、磺胺异噁唑、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考各适量(相当于各活性成分10mg),精密称定，于各自容量瓶中，喹诺酮类需加0.2mL甲酸，均用甲醇溶解后并稀释定容至100mL,配制成浓度为100μg/mL的标准储备液。避光-18℃以下保存，有效期1年。5.4.2氘代同位素内标标准储备液500μg/mL。取氘代磺胺邻二甲氧嘧啶、氘代磺胺间二甲氧嘧啶、氘代诺氟沙星、氘代环丙沙星、氘代恩诺沙星、氘代氯霉素内标各适量(相当于各活性成分5mg),精密称定，于各自容量瓶中，用甲醇溶解稀释定容至10mL。配制成浓度为500μg/mL同位素内标标准储备液，避光-18℃以下保存，有效期1年。5.4.3喹诺酮类与磺胺类混合标准工作液准确吸取各喹诺酮类和磺胺类标准储备液(5.4.1)适量，用甲醇稀释制成1.0μg/mL混合标准工作液，避光4℃冷藏保存，有效期1个月。5.4.4酰胺醇类混合标准工作液准确吸取各酰胺醇类标准储备液(5.4.1)适量，用甲醇稀释制成氯霉素、氟苯尼考0.1μg/mL,甲砜霉素0.5μg/mL混合标准工作液，避光4℃冷藏保存，有效期1个月。5.4.5磺胺类与喹诺酮类混合内标标准工作液：准确吸取各磺胺类和喹诺酮类内标标准储备液(5.4.2)适量，用甲醇稀释制成10.0μg/mL混合标准工作液，避光4℃冷藏保存，有效期1个月。5.4.6酰胺醇类混合内标标准工作液准确吸取各酰胺醇类内标标准储备液(5.4.2)适量，用甲醇稀释制成1.0μg/mL混合内标标准工作液，避光4℃冷藏保存，有效期1个月。4DB12/T1359—20245.5材料通过式固相萃取柱，200mg/6mL,或性能相当者。6仪器6.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾(ESI)离子源。6.2分析天平：感量0.01g、0.01mg。6.3高速离心机：转速大于10000r/min。6.4超声波震荡仪。6.5涡旋振荡器。6.6氮吹仪。6.7粉碎装置：如杵或研钵。6.8筛：筛孔为1mm金属网。7试样制备7.1试样制备7.1.1固态非规范药品按GB/T20195的规定制备试样，至少100g,粉碎使其全部通过1.0mm孔径的分析筛，装入密闭容器中备用。7.1.2液态非规范药品将样液过0.45μm滤膜，收集样液体积20mL,于密闭容器中保存。7.2试样保存将试样于4℃及以下条件下保存。8分析步骤8.1样品处理称取非规范药品0.1g(准确至0.01g),用水稀释至100mL,涡旋1min,超声波超声5min,取5mL置于50mL离心管中，加入50μL混合内标标准使用液(5.4.5、5.4.6),加入2.0gNaCl,再加入10mL酸化乙腈，涡旋1min,超声波超声5min,8000r/min离心3min,取上清液过固相萃取柱于20mL玻璃离心管中，再加入5mL酸化乙腈，重复上述操作，2mL乙腈淋洗固相萃取柱，合并收集液于40℃条件下，氮气吹至近干，残留物加入甲醇溶液(5.2.2)1mL,充分涡旋混匀，转移至1.5mL离心管中，20000r/min离心5min,取上清液过0.2μm有机相滤膜后，取100μL滤液，用甲醇溶液(5.2.2)定容至10.0mL,上机测定。8.2测定8.2.1磺胺类与喹诺酮类58.2.1.1色谱条件8.2.1.1.1色谱柱：Ci8色谱柱，1.7μm,100mm×2.1mm(内径),或性能相当。8.2.1.1.2柱温：35℃。8.2.1.1.3流速：0.25mL/min。8.2.1.1.5流动相：甲醇-(乙酸铵-甲酸溶液，5.2.1);洗脱程序见表1。表1流动相梯度洗脱程序时间(min)V./%V/%190640606.1908908.190908.2.1.2质谱条件8.2.1.2.1离子化模式：电喷雾离子源(ESI+),多反应监测。8.2.1.2.2喷雾电压：5500v。8.2.1.2.3气帘气压力：0.24MPa。8.2.1.2.4碰撞气压力：0.02MPa。8.2.1.2.5离子源温度：550℃。8.2.1.2.6碰撞室入口电压：10v。8.2.1.2.7碰撞室出口电压：10v。8.2.1.2.8驻留时间：50ms。8.2.1.2.9离子源Gasl:0.6MPa。8.2.1.2.10离子源Gas2:0.2MPa。8.2.1.2.11多反应监测母离子、子离子、解簇电压和碰撞能量见表2。表2多反应监测母离子、子离子、解簇电压和碰撞能量目标化合物母离子m/z子离子m/z解簇电压V碰撞能量磺胺噻唑2568585磺胺嘧啶2518585磺胺甲基异噁唑2548585磺胺二甲嘧啶2798585磺胺甲基嘧啶26585856DB12/T1359—2024磺胺多辛8585磺胺喹噁啉8585磺胺异噁唑2688585诺氟沙星320.3233.485276.3*85环丙沙星332.2245.385288.3*85恩诺沙星360.2245.2*90316.390氧氟沙星26185318*85培氟沙星29085316*85洛美沙星26585308*85氘代诺氟沙星325.3307.285氘代环丙沙星340.3322.385氘代恩诺沙星365.3321.394氘代磺胺间二甲氧嘧啶85氘代磺胺邻二甲氧嘧啶85注：*为定量碎片离子8.2.1.3标准工作曲线分别准确移取标准工作液适量，甲醇溶液(5.2.1)定容至1mL,喹诺酮类与磺胺类稀释成质量浓度为5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL、200ng/mL,内标液浓度均为50ng/mL。8.2.2酰胺醇类测定8.2.2.1色谱条件8.2.2.1.1色谱柱：C18色谱柱，1.7μm,100mm×2.1mm(内径),或性能相当。8.2.2.1.2柱温：35℃。8.2.2.1.3流动相：甲醇-水；流动相洗脱程序见表3。8.2.2.1.4流速：0.3mL/min。表3流动相梯度洗脱程序7DB12/T1359—2024时间(min)V./%V%1906406.1908908.190908.2.2.2质谱条件8.2.2.2.1离子化模式：电喷雾离子源(ESI-),多反应监测。8.2.2.2.2喷雾电压：-5500v。8.2.2.2.3气帘气压力：0.24MPa。8.2.2.2.4碰撞气压力：0.02MPa。8.2.2.2.5离子源温度：550℃。8.2.2.2.6碰撞室入口电压：10v。8.2.2.2.7碰撞室出口电压：10v。8.2.2.2.8驻留时间：100ms。8.2.2.2.9离子源Gasl:0.6MPa。8.2.2.2.10离子源Gas2:0.2MPa。8.2.2.2.11多反应监测母离子、子离子、解簇电压和碰撞能量见表4。表4多反应监测母离子、子离子、解簇电压和碰撞能量目标化合物母离子m/z子离子m/z解簇电压V碰撞能量氯霉素-55-24257-55-18甲砜霉素290-55-18-55-27氟苯尼考-55-14336*-55-27氘代氯霉素334.1318.1*-55-26注：*为定量碎片离子8.2.2.3标准工作曲线分别准确移取标准工作液适量，甲醇溶液(5.2.1)定容至1mL,氯霉素、氟苯尼考稀释至0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL,甲砜霉素稀释至2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、25.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL,内标液浓度均为5.0ng/mL,供液相色谱-串联质谱仪测定。8离子丰度比(%)允许相对偏差(%)试样中各药物残留量以质量分数w计，单位为毫克每千克(mgkg),按公式(1)或公式(2)计…@——试样中被测物残留量的数值，单位为毫克每千克(mg/kg);9DB12/T1359—2024P₁——标准工作液中被测物的质量浓度数值，单位为毫克每升(mg/L);P₂——标准工作曲线中得到的试样溶液中被测物的质量浓度数值，单位为毫克每升(mg/L);A——试样溶液中被测物的质量色谱图峰面积；As——标准工作液中被测物的质量色谱图峰面积；A,——试样溶液中内标物的质量色谱图峰面积；Ais——标准工作液中内标物的质量色谱图峰面积；V——提取液体积的数值，单位为毫升(mL);m——试样质量数值，单位为(g).计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，保留2位有效数字，含量超1mg/kg时保留3位有效数字。10正确度和精密度10.1正确度磺胺类、喹诺酮类、酰胺醇类测定回收率为70%~110%。10.2精密度本方法的批内相对标准偏差小于15%,批间相对标准偏差小于15%。11其他本实验条件下非规范药品中喹诺酮类、磺胺类定量限为1.0mg/kg;氯霉素、氟苯尼考定量限为0.1mg/kg,氟苯尼考定量限为0.5mg/kg。DB12/T1359—2024(规范性)17种抗生素中英文对照索引17种抗生素中英文对照索引，见表A.1。表A.117种抗生素中英文对照索引序号药物中文名药物英文名CAS号分子式1诺氟沙星Norfloxacin70458-96-7C₁₆H₈FN₃O₃2环丙沙星Ciprofloxacin85721-33-1C₁₇H₈FN₃O₃3恩诺沙星Enrofloxacin93106-60-6C₁₉H₂₂FN₃O₃4氧氟沙星Ofloxacin82419-36-1C₁₈H₀FN₃O₄5培氟沙星Pefloxacin70458-92-3C₁₇H₀FN₃O₃6洛美沙星Lomefloxacin98079-51-7C₁₇Hi₉F₂N₃O₃7磺胺噻唑Sulfathiazole72-14-0C₄H₉N₃O₂S₂8磺胺嘧啶Sulfadiazine68-35-9C₀H₁N₄O₂S9磺胺甲基异噁唑Sulfamethoxazole723-46-6C₀H₁N₃O₃S磺胺二甲嘧啶Sulfamethazine57-68-1C₁₂H₄N₄O₂S磺胺甲基嘧啶Sulfamerazine127-79-7C₁H₂N₄O₂S磺胺多辛Sulfadoxine2447-57-6C₁₂H₄N₄O₄S磺胺喹噁啉Sulfaquinoxaline59-40-5C₄H₂N₄O₂S磺胺异噁唑Sulfisoxazole127-69-5C₁H₃N₃O₃S氯霉素Chloramphenicol56-75-7CnH₁₂Cl₂N₂O₅甲砜霉素Thiamphenicol15318-45-3C₁₂H₁₅Cl₂NO₅S氟苯尼考Florfenicol73231-34-2C₁₂H₁₄Cl₂FNO₄S1.00e6XIC-of+MRM(33pairs):256.000/156.3.02磺胺噻唑XICof+MRM(33pairs):254.000/156.000DaID:jiaezuo2fromSample118(50)ofD…5.0e5■XICof+MRM(33pairs):251.000/156.000Da1.00e6■XICof+MRM(33pairs):311.001/156.000DaID:liner■XICof+MRM(33pairs);301.000/156.0xICof+MRM(33pairs):279.0/156.000pairs):268.000/156.0pairs):268.000/156.02.0e5一