周建平－药品热原检查与细菌内毒素检查方法介绍

周建平

现任北京市药品检验所药理毒理室主任，主任药师。担任北京市高级专业技术职务评审委员、北京药理学会理事、中国药理学会药检药理专业委员会委员、第八界药典委员会委员。周建平同志一直从事药品检验，尤其是药品的生物检定工作，工作中积累了较丰富的实践经验，代培了本单位和外单位多名进修人员，自担任科室主任以来主要负责科室的药品检验的技术把关工作，指导科室同志完成上级的检验任务，在工作中不断汲取药品检验领域的新知识，不断培养骨干力量，现在科室已拥有一批技术过硬的生物检定人员。本人屡次承担中检所和药典会下达的复核任务、标定任务及注射剂标准提高的工作。作为北京市药监局药理毒理审评专家，经常参加新药审评工作，指导研究企业和本单位的科研和把关工作。3/6/20251药品热原检查与细菌内毒素检查方法介绍北京市药品检验所药理室周建平2021年4月3/6/20252药品平安性检验内容热原检查〔PyrogenTest)细菌内毒素检查〔BacterialEndotoxinTest〕异常毒性检查降压物质检查过敏法反响检查法降钙素生物测定法生长激素生物测定法溶血与凝聚检查法3/6/20253热原检查〔PyrogenTest)热原的含义热原检查法根本原理热原检查法根本操作试验操作本卷须知3/6/20254热原的含义热原系指某些药品中含有的能引起体温升高的杂质。热原经静脉注入人体后15分钟即能产生强烈的发热反响，重者昏迷甚至危及生命。热原主要来源于革兰阴性菌的细菌内毒素。3/6/20255热原检查法根本原理被测物试验动物给药方法测定设备判断标准供试品溶液（输液、小针、粉针、注射用原料）家兔耳静脉注射肛温计或测温仪给药后体温变化3/6/20256试验根本原理家兔热原实验与人体的热原反响有什么样联系？1969年Greisman和Hornick研究比较了三种纯化内毒素对家兔和健康男性志愿者的反响，结果说明：人和家兔产生热原反响需要大约相同重量的细菌内毒素，但当热原的剂量增加时，人体反响较家兔更为强烈。3/6/20257热原剂量确定实验的设计是基于在不超过10分钟的时间内，给予家兔静脉注射使动物能够耐受的，不多于10ml/kg体重剂量的受试药物。?中国药品检验标准操作规程?2005版提出“供试品的剂量应按各该药项下的规定注射，未规定剂量的药品，可根据该药的药理性质，在不影响家兔正常生理的前提下，按体重计算〔人按50kg计〕，用临床一次剂量的3-10倍〞家兔热原实验中的热原阈值剂量应当认为是最低标准，对于人体而言应尽可能的提高几倍实验的平安范围。3/6/20258热原检查法根本操作实验材料及设备实验准备实验动物实验环境供试液配制新兔预选家兔重复使用检查法结果判断〔合格、复试、重做、不合格〕3/6/20259实验材料及设备计量设备〔天平、公斤称等〕电热枯燥箱〔可达250℃以上〕恒温水浴〔37～38℃〕家兔固定盒热原测温仪或肛温计〔测温探头或肛温计〕其它用品〔7#针头、12#针头、注射器、直镊、配制容器、灭菌注射用水、氯化钠注射液、酒精棉球等〕3/6/202510实验准备热原测温仪或肛温计定期校验，符合计量认证的要求。实验用具的除热原处理：试验用注射器、针头及一切与供试品溶液接触的器皿，洗涤，枯燥，250℃,30分钟以上。3/6/202511实验动物动物品系：均为远交系动物，普通级饲养。日本大耳白〔JapaneseWhite〕，新西兰白〔NewZealandWhite〕，青紫蓝，比利时白〔BelgianWhite〕，Chinchillas和DutchBelts要求：健康合格、1.7～3.0kg、同一来源和品系。性别:雌雄均可。雌性动物，比较温顺，易于捉持，体重增长较缓慢动物的检疫、标记：一周的检疫期，动物编号和笼具编号3/6/202512实验环境实验室温度：17-25℃实验室与饲养室温差：≤5℃实验温度变化：≤3℃实验室：保持安静，防止强光、噪音等刺激，注意实验兔之间相互影响。3/6/202513供试液配制1、固体样品注意称量、稀释时的操作，防止热原和其它污染。2、样品稀释时应注意准确性并尽量减少误差。3、配制时应注意含量或效价(抗生素〕的折算问题以及总量是否够试验之用。4、稀释用的灭菌注射用水及氯化钠注射液宜经鲎试剂检查合格再用于稀释。3/6/202514新兔预选1、新兔→饲养7日以上2、预测体温〔条件同热原检查〕：测温8次、间隔0.5小时。3、中选条件：体温在38.0～39.6℃，8次测温变化≤0.4℃〔可供3周使用〕3/6/202515实验兔重复使用1、结果符合规定的实验兔，休息48hr2、复试用兔升温＜0.6℃且供试品合格，休息48hr3、使用次数未达10次的实验兔4、复试用兔升温≥0.6℃且供试品合格，按新兔测温合格〔以上实验兔可重复使用〕5、结果不符合规定的实验兔6、使用次数达10次的实验兔〔以上实验兔不可再使用〕3/6/202516家兔重复使用

美国药典27版仅仅规定了家兔使用频率，并没有规定年龄限制和重复使用长度，使用的频率规定不得超过每2天1次，假设在热原实验中最大升温0.6度或更高，以及热原实验结果为阳性时，间隔时间不得小于2周。动物重复使用的长度在很大程度上取决于所检测的样品的性质，当家兔成熟时开始进入热原实验，至少可使用2年3/6/202517检查法1、取合格兔，停食、停水，称重并固定约1小时2、每隔30分钟测温一次，致连续2次温差≤0.2℃，并算得2次均值为正常体温。3、及时配制供试液并预热至37～38℃4、选兔并分组〔初试3只/组、组内温差＜1.0℃；复试5只/组〕5、注射供试液〔分组后15分钟内〕6、计时开始并记录6次体温，间隔0.5小时，以6次中最高温度减去该兔正常体温为升温值3/6/202518注射体积和注射速度

通常给药剂量≤10ml/kg体重，并应在10分钟内完成注射。一般情况下，注射的速度和体积并不影响发热反响，大局部受试溶液可以在1-2min内注射完成，但局部受试产品具有明显和迅速的药理作用，可影响或干扰发热反响，需要缓慢进行注射3/6/202519结果判断1、复试：初试3只兔中仅1只升温≥0.6℃或3只兔升温均小于0.6℃、但升温总和≥1.4℃，应另取5只复试。2、合格：初试3只兔升温均小于0.6℃且升温总和＜1.4℃；5只复试中仅1只升温≥0.6℃且初试、复试共8只兔升温总和≤3.5℃。3、不合格：初试3只兔中有2只升温≥0.6℃；复试5只中2只以上升温≥0.6℃；初试、复试共8只兔升温总和≥3.5℃。3/6/202520内毒素发热的峰型呈典型的双峰型，前2小时内，先是持续15-18分钟的缓慢升温，随后是快速地到达顶峰，经短暂的温度降低之后是第2个升温时相，经6-9小时后体温恢复到基线值。但当内毒素的量很高时，表现为快速的升温，没有典型的双峰型。3/6/202521影响实验的其他因素

导致发热减低药物不适合家兔热原实验，如：解热镇痛药物、催眠药物、局麻药物、吩噻嗪衍生物等。磷酸缓冲液和其他特异的缓冲液，即使不含有细菌内毒素，静脉输入足量的离子也可引起家兔热原样反响甾体激素和抗生素在许多哺乳动物可引起发热3/6/202522鲎试剂与细菌内毒素检查法

3/6/202523细菌内毒素检查相关理论及概念细菌内毒素鲎试剂鲎试剂与内毒素的反响机理细菌内毒素检查3/6/202524细菌内毒素〔细菌内毒素与热原的关系〕热原〔Progen〕指临床上能使哺乳类动物产生热原反响的物质。细菌内毒素〔Endotoxin〕革兰阴性细菌细胞壁的构成成分，具有多种生物活性，其化学结构是脂多糖〔LPS〕。热原与内毒素的关系在学术上仍有争论，但在GMP的条件下，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就控制热原。

3/6/202525细菌内毒素定义变化过去一直认为，细菌内毒素来源于革兰阴性细菌，但最近发现革兰阴性菌之外的其它菌中发现内毒素或内毒素样分子结构，如真核小球藻样绿藻。所有内毒素均为脂多糖〔LPS〕，但并非所有的脂多糖均为内毒素，因为其不具有相关的毒性。如：肽聚糖、葡聚糖。3/6/202526细菌内毒素的生物活性致热性引起血液中粒细胞下降激活凝血系统血压下降引起淋巴细胞的有丝分裂与鲎试剂反响3/6/202527广泛存在非常稳定其疏水末端非常易于自身或者与玻璃容器结合而聚集，而不是与水混合致热活性的高度不均一性细菌内毒素的特征3/6/202528细菌内毒素标准品的建立不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反响活性不同，为保证鲎实验法的平行性和重复性，要建立一种内毒素的标准物质作为实验中的控制标准。由于大肠杆菌内毒素在天然内毒素中的致热活性比较高，在各种细菌内毒素对鲎试剂反响的灵敏性上处于中值的位置，且其稳定、可溶，因此一般都采用大肠杆菌的内毒素作为标准内毒素标准品。3/6/202529

标准内毒素标准内毒素：指经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为细菌内毒素检查的标准品。国际标准品〔IS〕标准品〔RSE〕国家标准品〔RSE〕标准内毒素

工作标准品〔CSE〕

3/6/20253080年代以前以重量作为内毒素的单位1982年USP20引入以生物效价为量值的内毒素单位〔EU，EndotoxinUnit〕细菌内毒素的量值3/6/202531

CP2000年版规定内毒素标准品溶解后要在旋涡混合器上混合15分钟，以后的每一步稀释前要至少混合30秒，其他国家药典也有类似要求；具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布

不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确的实验结果

细菌内毒素标准品的稀释3/6/2025323/6/202533鲎试验的发现1956年JohnsHophins大学动物学家Frederik.Bang发现革兰阴性细菌的粗制品能使鲎的血细胞凝聚。1963～1964年Jack.Levin和Bang对细菌引起鲎血凝聚进行研究，用内毒素和鲎血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种酶反响。多位学者对鲎血细胞溶解物〔LAL〕进行研究，阐释了凝聚机制3/6/202534鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻枯燥制备而成鲎试剂的种类：依据鲎的种类分：美洲鲎试剂〔LAL〕中国鲎试剂〔TAL〕圆尾鲎试剂〔CAL〕依据检查方法分：凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂依据内毒素和鲎试剂反响的专一程度分：普通鲎试剂和特异性鲎试剂鲎试剂与分类3/6/2025353/6/202536灵敏度自身凝集缓冲能力水分微生物检查鲎试剂的质量控制指标3/6/202537C因子活化的C因子内毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白原β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM活化的G因子（旁路反应）G因子二价阳离子凝胶法鲎试剂与内毒素的反响机理——复杂的酶促反响过程3/6/202538美国和中国BET开展历史1991部颁标准规定了4个品种采用细菌内毒素检查方法，结果阳性时以家兔热原检查法判定。1993年中国药典第二增补本开始收载该法1995年附录收载了经修订的细菌内毒素检查法，正文收载了13个品种。2000年收载69个品种，并收载了?细菌内毒素检查法应用指导原那么?2005年版改热原73品种，增订112品种，共计252个品种USP24版收载680多品种进行内毒素检查，保存热原检查的药品缺乏30种3/6/202539国内鲎试剂的生产情况安度斯生物技术湛江海洋生物制品厂福州新北鲎试剂厂厦门鲎试剂厂福州东方鲎试剂厂福州平潭东方鲎试剂厂广西北海鲎试剂厂3/6/202540细菌内毒素检查法的目的和前提确保药品不含有能导致患者发热反响发生的足量的细菌内毒素。一定量的细菌内毒素可以被人体耐受，也是SFDA允许的。前提是假定引起发热反响的热原几乎全部是内毒素。3/6/202541细菌内毒素检查法凝胶法光度测定法浊度法〔终点浊度法和动态浊度法〕显色基质法〔终点显色法和动态显色法〕3/6/202542凝胶法最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁〞方法对干扰相对不敏感。有两倍的误差较光度测定法不灵敏3/6/202543光度测定法灵敏〔动态浊度检测限0.001EU/ml，动态显色0.005EU/ml〕检测范围宽〔动态浊度到达100EU/ml,动态显色50EU/ml〕较之凝胶法易受干扰对结果的解释更慎重。3/6/202544一、凝胶法

〔一〕检查法的描述〔二〕实验准备实验器械的要求检查用水的要求工作标准品稀释制备供试品的制备〔三〕实验局部鲎试剂灵敏度复核干扰实验检查法：限量试验半定量试验3/6/202545〔一〕检查法的描述本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，光度测定法包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。3/6/202546〔二〕实验准备-实验器具的要求1.实验器具的要求：试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。假设使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。3/6/202547〔二〕实验准备-检查用水的要求2.细菌内毒素检查用水〔BET的要求〕：凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。3/6/202548〔二〕实验准备－－工作标准品的稀释3.细菌内毒素工作标准品的稀释〔以150EU/支为例〕取1支〔150EU/支〕+1mlBET水→150EU/ml取0.3ml〔150EU/ml〕+2.7mlBET水→15EU/ml取2ml〔15EU/ml〕+1mlBET水→10EU/ml取0.5ml〔10EU/ml〕+4.5mlBET水→1EU/ml取2ml〔1EU/ml〕+2mlBET水→0.5EU/ml取2ml〔0.5EU/ml〕+2mlBET水→0.25EU/ml3/6/202549〔二〕实验准备-供试品溶液的制备4．供试品溶液的制备某些供试品〔如粉针剂〕须进行复溶、稀释成所需浓度的溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液〔或其稀释液〕的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。3/6/202550〔二〕实验准备-供试品溶液的制备根据药品、生物制品的细菌内毒素限值〔L〕确定最大有效稀释倍数。最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。公式：MVD=cL/λ3/6/202551〔二〕实验准备-供试品溶液的制备L：供试品的细菌内毒素限值c：供试品溶液的浓度λ：在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度〔EU/ml〕。3/6/202552〔二〕实验准备-供试品溶液的制备计算举例：a、当L以EU/ml表示时，那么C等于1.0ml/ml适用于供试品为溶液状态，其限值为应小于xxEU/ml。例：脑蛋白水解物氯化钠注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，那么MVD=1.0ml/ml0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍

3/6/202553〔二〕实验准备-供试品溶液的制备b、当L以EU/mg或EU/U表示时，浓度c的单位需为mg/ml或U/ml。适用于供试品为固体状态，如粉针；或液体但是规定限值为应小于xxEU/mg或EU/U3/6/202554〔二〕实验准备-供试品溶液的制备例：注射用头孢哌酮钠〔供试品为注射用无菌粉末或原料药〕设MVD为1，计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L；计算得到的最小有效稀释浓度即为MVD下的该供试品的浓度。

计算限值为0.05EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验。最小有效稀释浓度c=0.125EU/ml÷0.05EU/mg=2.5mg/ml3/6/202555〔三〕实验局部凝胶法a鲎试剂灵敏度复核b干扰实验c检查法：限量试验半定量试验

3/6/202556鲎试剂灵敏度的复核鲎试剂灵敏度的定义：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度，即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时应进行鲎试剂灵敏度的复核。复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。3/6/202557鲎试剂灵敏度的复核根据鲎试剂灵敏度的标示值〔λ〕，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作用细菌内毒素检查用水溶解，制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管，另外2管阴性对照〔共18管〕。37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是否变形和滑落判断试验结果。注意保温和拿取试管的过程应防止受到振动造成假阴性结果。3/6/202558鲎试剂灵敏度复核内毒素浓度2λλ 0.5λ0.25λ阴性对照

鲎试剂

平行管

3/6/202559鲎试剂灵敏度复核结果判断：

假设最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。结果计算：

反响终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值〔λc〕。λc=lg-1〔∑X/4〕式中X为反响终点浓度的对数值〔lg〕。反响终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。3/6/202560鲎试剂灵敏度复核试验内毒素浓度

2λλ0.5λ0.25λ阴性对照终点

鲎试剂

0.5λ平行管

0.5λ

λ

λ

3/6/202561鲎试剂灵敏度复核试验λc=lg-1〔〔lg0.5λ+lg0.5λ+lgλ+lgλ〕/4〕=0.707λ当λc在0.5λ～2λ〔包括0.5λ和2λ〕时，方可用于细菌内毒素检查。实验时，以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。3/6/202562凝胶法----凝胶限量试验检验供试品中的内毒素含量是否小于限值的定性方法。每批供试品必须做2支供试品管2支供试品阳性对照

同时

每次实验须做2支阳性对照和2支阴性对照。

3/6/202563凝胶法----凝胶限量试验

编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2供试品溶液B2λ/供试品溶液2供试品阳性对照C2λ/检查用水2阳性对照D无/检查用水2阴性对照当阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。3/6/202564凝胶法----凝胶限量试验

例：脑蛋白水解物氯化钠注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，计算MVD=1.0ml/ml

0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照供试品溶液：4倍脑蛋白水解物氯化钠稀释液供试品阳性对照为：含0.25EU/ml标准内毒素的4倍脑蛋白水解物氯化钠稀释液阳性对照为：浓度为0.25EU/ml的标准内毒素溶液3/6/202565凝胶法----凝胶限量试验

例：脑蛋白水解物氯化钠注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，计算MVD=1.0ml/ml

0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照

此批脑蛋白水解物氯化钠注射液的内毒素含量小于0.5EU/ml，符合规定。3/6/202566凝胶法----凝胶限量试验

例：脑蛋白水解物氯化钠注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，计算MVD=1.0ml/ml

0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照

此批氯化钠注射液的内毒素含量不小于0.5EU/ml，

不符合规定。3/6/202567凝胶法----凝胶限量试验

例：脑蛋白水解物氯化钠注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，计算MVD=1.0ml/ml

0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照须复试〔另取10支〕。3/6/202568凝胶法----凝胶限量试验

复试时，供试品溶液需做4支平行管，假设所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否那么判供试品不符合规定。供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照3/6/202569凝胶法----凝胶半定量试验

半定量试验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法。系通过确定反响终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。3/6/202570凝胶法----凝胶半定量试验

原理：通过供试品系列稀释液与鲎试剂反响，其反响终点浓度的稀释倍数与鲎试剂灵敏度的乘积即为供试品的内毒素含量。操作：用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释，制备成2、4、8倍的稀释液，但最大稀释倍数不得超过所使用鲎试剂的MVD。3/6/202571编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液检查用水1248—2222B2λ/供试品溶液12λC2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ2222D无/检查用水———2A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品系列稀释液。B：供试品阳性对照。〔为确证不存在干扰作用〕C：标准内毒素系列。〔为确证本次试验的操作和环境都符合要求。〕D：阴性对照。

3/6/202572凝胶法----凝胶半定量试验

结果判断：当阴性对照溶液D的平行管均为阴性供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性系列溶液C的反响终点浓度的几何平均值在0.5λ～2λ之间试验有效3/6/202573凝胶法----凝胶半定量试验

结果计算：内毒素浓度2.0λλ0.5λ0.25λ终点标准内毒素系列溶液C稀释倍数1248供试品系列溶液APPC溶液BNC溶液D3/6/202574凝胶法----凝胶半定量试验

结果计算：内毒素浓度2.0λλ0.5λ0.25λ终点标准内毒素系列溶液C0.5λλ稀释倍数1248供试品系列溶液APPC溶液BNC溶液Dλc=lg-1〔∑X/2〕=0.707λ，在0.5λ～2λ之间仍以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。3/6/202575凝胶法----凝胶半定量试验

结果计算：内毒素浓度2.0λλ0.5λ0.25λ终点标准内毒素系列溶液C0.5λλ稀释倍数1248供试品系列溶液A4

λ2

λPPC溶液BNC溶液DCE=lg-1〔∑X/2〕=lg-1〔〔lg4λ+lg2λ〕/2〕=2.83λ3/6/202576凝胶法----凝胶半定量试验

结果计算：如果检验时采用的是供试品的稀释液，那么计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。

3/6/202577凝胶法----凝胶半定量试验

结果计算：例：右旋糖酐20葡萄糖注射液，限值为0.5EU/ml。

通过使用3个鲎试剂厂家的鲎试剂对3个不同厂家的7批样品进行干扰试验证实：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀释2倍后即不干扰内毒素检查。

使用灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂对一批右旋糖酐20葡萄糖注射液进行凝胶半定量试验。3/6/202578凝胶法----凝胶半定量试验

例：计算MVD

MVD=0.5EU/ml/0.03EU/ml=16.67倍从已确定不干扰的稀释倍数2倍起，再进行1、2、4、8倍的稀释。〔相当于又将供试品原液进行了4、8、16倍稀释，最终的稀释倍数没有超过MVD。〕

3/6/202579凝胶法----凝胶半定量试验

例：内毒素浓度0.060.030.0150.0075终点标准内毒素系列溶液C0.0150.03稀释倍数

1248右旋糖酐20葡萄糖注射液系列溶液A4

0.032

0.03PPC溶液BNC溶液DCE=lg-1〔∑X/2〕=lg-1〔〔lg40.03+lg20.03〕/2〕=2.830.03=0.0849EU/ml3/6/202580凝胶法----凝胶半定量试验

例：由于检验时采用的是右旋糖酐20葡萄糖注射液的最小不干扰稀释倍数——2倍稀释液，因此计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数2。原右旋糖酐20葡萄糖注射液中内毒素含量为：2

0.0849=0.170EU/ml

3/6/202581凝胶法----凝胶半定量试验

结果计算：如试验中供试品溶液的结果都为阴性，应记为内毒素浓度小于λ〔如果检验的是稀释过的供试品，那么记录为小于λ乘以该供试品的最低稀释倍数〕。

3/6/202582凝胶法----凝胶半定量试验

例：内毒素浓度0.060.030.0150.0075终点标准内毒素系列溶液C0.0150.03稀释倍数

1248右旋糖酐20葡萄糖注射液系列溶液A<1

0.03<1

0.03PPC溶液BNC溶液DCE<lg-1〔∑X/2〕=λ=0.03EU/ml20.03=0.06EU/ml原右旋糖酐20葡萄糖注射液中内毒素含量为：小于0.06EU/ml3/6/202583凝胶法----凝胶半定量试验

结果计算：如果结果都为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。3/6/202584凝胶法----凝胶半定量试验内毒素浓度0.060.030.0150.0075终点标准内毒素系列溶液C0.0150.03稀释倍数

1248右旋糖酐20葡萄糖注射液系列溶液A>8

0.03>8

0.03PPC溶液BNC溶液DCE>lg-1〔∑X/2〕=8λ=0.24EU/ml20.24=0.48EU/ml原右旋糖酐20葡萄糖注射液中内毒素含量为：大于0.48EU/ml3/6/202585

例：CE>lg-1〔∑X/2〕=8λ=0.24EU/ml20.24=0.48EU/ml原右旋糖酐20葡萄糖注射液中内毒素含量为：大于0.48EU/ml3/6/202586凝胶法----凝胶半定量试验

假设内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。假设内毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。3/6/202587细菌内毒检查方法学研究的内容一、前言二、细菌内毒素限值确实定三、确定细菌内毒素检查的有效浓度范围四、鲎试剂灵敏度的复核五、凝胶法干扰试验----方法学六、制定药物的质量标准七、中国药典收载细菌内毒素检查法的情况3/6/202588一、前言：

新品种细菌内毒素检查的设计原理如果药品中存在阻碍或促进该反响的因素时，均会导致结果的异常。当检测一个新品种中内毒素时，须证明该样品本身是否存在这些因素，这就是通常说的干扰试验。当其存在某种干扰因素时，为了排除干扰，最简单的方法就是对其进行适当的稀释。通过稀释，可以降低该样品中干扰成份的浓度，需在此根底上对样品进行其他方法的处理。3/6/202589二、细菌内毒素限值〔L)确实定药品细菌内毒素检查是一种限度试验，首先必须确定供试品的细菌内毒素限值。当供试品含内毒素低于这个限值时，按规定给药途径用药，就不会引起热原反响；相反就有可能引起热原反响。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。3/6/202590二、细菌内毒素限值〔L)确实定药品、生物制品细菌内毒素限值按下式确定：L=K/M式中，L为供试品内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K为人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/〔kg.h〕表示，注射剂K=5EU/〔kg.h〕；鞘内用注射剂K=0.2EU/〔kg.h〕;放射性药品注射剂K=2.5EU/〔kg.h〕。M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/〔kg.h〕、mg/〔kg.h〕或U/〔kg.h〕表示,人均体重按60kg计算，注射时间假设缺乏１小时，按１小时计算。3/6/202591二、细菌内毒素限值〔L)确实定计算举例：注射用阿莫西林钠根据国家药典会?临床用药须知?所载本品临床用法用量为：“肌肉注射或稀释后静脉滴注，一次0.5~1g，一日3~4次；小儿按体重每日50~100mg/kg，分3~4次静脉滴注。〞M成人＝1000mg÷60kg=16.67mg/(kg.h)M儿童＝100mg/(kg.h)÷3=33.3mg/(kg.h)L=K/M=5EU/(kg.h)÷33.3mg/(kg.h)=0.150EU/mg3/6/202592二、细菌内毒素限值〔L)确实定限值计算时做必要调整的几种情况从严原那么〔已有国家标准、国外药典收载的品种，执行严的〕联合用药特殊情况3/6/202593三、确定内毒素检查的有效浓度范围为了确定供试品进行细菌内毒素检查的有效浓度范围，首先要计算供试品进行细菌内毒素检查时的稀释倍数〔MVD)。其最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：MVD=CL/λ式中，L为供试品的内毒素限值;C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，那么C等于1.0ml/ml;当L以EU/mg或EU/U活性单位表示时，那么C的单位为mg/ml或U活性单位／mlλ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)。3/6/202594三、确定内毒素检查的有效浓度最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。MVD=cL/λL:供试品的细菌内毒素限值C:供试品溶液的浓度λ：在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度〔EU/ml),或是光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度〔如标准曲线为50、5、0.5EU/ml组成。3/6/202595三、确定内毒素检查的有效浓度计算举例：a:当L以EU/ml表示时，那么c=1.0ml/ml适用于供试品为溶液状态，并且规定限值为应小于xxEU/ml。例如：葡萄糖注射液，规定限值为应小于0.5EU/ml，当使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验时，那么MVD=1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍3/6/202596三、确定内毒素检查的有效浓度计算举例：b、当L以EU/mg或EU/U表示时，浓度C的单位需为mg/ml或U/ml。适用于供试品为固体状态，如粉针；或液体但是规定限值为应小于xxEU/mg或EU/U注：注射液一般以EU/ml表示原料及注射用粉针一般用EU/mg表示3/6/202597三、确定内毒素检查的有效浓度例如：注射用阿莫西林钠计算限值为0.150EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验。如称取100mg注射用阿莫西林钠，用5ml细菌内毒素检查用水溶解，即成为浓度为20mg/ml的阿莫西林钠溶液。MVD=20mg/mlx0.15EU/mg÷0.125EU/ml=24倍〔20mg/24倍=0.833mg/ml)3/6/202598三、确定内毒素检查的有效浓度如供试品为注射用无菌粉末或原料药，那么MVD取1，计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L.适用于供试品为固体的情况，计算得到的最小有效稀释浓度即MVD下的该供试品的浓度。如：注射用阿莫西林钠L=0.15EU/mg,使用鲎试剂λ=0.125EU/ml,那么C=0.125EU/ml÷0.15EU/mg=0.833mg/ml3/6/202599三、确定内毒素检查的有效浓度根据公式MVD=CL/λ由于目前市场鲎试剂的灵敏度范围一般为0.5EU/ml-0.03EU/ml当当λ=λmin时，Cmin=Coλmin/L当λ=λmax时，Cmax=Coλmax/L3/6/2025100三、确定内毒素检查的有效浓度例：以注射用青霉素钠为例。其L为应小于0.01EU/100UCmax=0.5EU/ml/0.01EU/100U=5000U/ml(λ为0.5EU/ml)Cmin=0.03EU/ml/0.01EU/100U=300U/ml(λ为0.03EU/ml)3/6/2025101四、鲎试剂灵敏度的复核鲎试剂灵敏度的定义：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度，即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时应进行鲎试剂灵敏度的复核。复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。3/6/2025102四、鲎试剂灵敏度的复核根据鲎试剂灵敏度的标示值〔λ〕，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作用细菌内毒素检查用水溶解，制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管，另外2管阴性对照〔共18管〕。37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是否变形和滑落判断试验结果。注意保温和拿取试管的过程应防止受到振动造成假阴性结果。3/6/2025103四、鲎试剂灵敏度的复核结果判断：假设最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性，试验方为有效。结果计算：反响终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值〔λc)λc=lg-1(∑X/4),其中X为反响终点浓度的对数值〔lg)反响终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。解释试验阳性对照和供试品阳性对照用2λ的原因。3/6/2025104四、鲎试剂灵敏度的复核内毒素浓度2λλ0.5λ0.25λ阴性终点鲎试剂++---λ平行管++---λ+++-0.5λ+++-0.5λλc=lg-1(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)/4=0.707λ如果出现反跳现象，那么考虑试验操作是否正确。3/6/2025105四、鲎试剂灵敏度的复核当λc在0.5λ~2λ〔包括0.5λ和2λ〕时，方可用于内毒素检查。但是注意要以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。北京市药品检验所负责北京地区鲎试剂的标化工作，只有在其测定值就是标示值的情况下才外卖。3/6/2025106五、凝胶法干扰试验目的：确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反响不存在干扰作用，为产品能否用细菌内毒素检查法提供依据，并且验证供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时，供试品是否存在干扰作用。3/6/2025107五、凝胶法干扰试验导致干扰的因素：pH值〔酸、碱均抑制凝集〕抗凝因子〔抑制作用〕螯合剂〔钙、镁离子等〕葡聚糖〔旁路反响、增强作用〕……3/6/2025108五、凝胶法干扰试验排除干扰的方法：稀释中和过滤加热…….3/6/2025109五、凝胶法干扰试验试验操作：在干扰试验中，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数〔MVD)的溶液。即与所使用的鲎试剂反响，不出现阳性的供试品溶液。3/6/2025110五、凝胶法干扰试验预试验目的：初步确定供试品的最大不干扰浓度〔当限值以EU/mg或EU/U活性单位表示〕或最小不干扰稀释倍数〔当限值以EU/ml表示〕，为正式干扰实验提供依据。预实验的优点是减少摸索过程、节约本钱。最大不干扰浓度：Cmax=λmax/L最小不干扰倍数：MVDmax=L/λmaxλ3/6/2025111五、凝胶法干扰试验预试验将供试品进行一系列倍数的稀释。〔有效稀释范围〕。使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照管〔即含2λ内毒素的供试品稀释液〕另做2支阴性对照和2支阳性对照。3/6/2025112五、凝胶法干扰试验预试验---结果判断当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数或最大不干扰稀释浓度。因此选择此稀释倍数或浓度的溶液进行正式干扰实验。3/6/2025113凝胶法干扰预试验预试验稀释倍数供试品溶液PPCNCPC原液5倍10倍20倍40倍MVD0.5MVD0.25MVD0.125MVD0.06MVD0.033/6/2025114凝胶法干扰试验预试验阴性阳性稀释倍数原液5倍10倍20倍40倍供试品溶液PPCNCPC如上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍，可在此浓度下进行正式干扰实验。3/6/2025115五、凝胶法干扰试验正式干扰实验目的：检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反响有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。3/6/2025116凝胶法干扰试验正式干扰试验操作：用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品分别制备一系列浓度的内毒素溶液。同时制备2支供试品阴性对照和2支阴性对照。

按表1制备溶液A、B、C和D3/6/2025117编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液---2B2λ/供试品溶液供试品溶液12λ4

21λ4

40.5λ4

80.25λ4C2λ/检查用水检查用水12λ4

21λ4

40.5λ4

80.25λ4D无/检查用水---23/6/2025118五、凝胶法干扰试验正式干扰试验结果判断：当供试品阴性对照和水阴性对照都为阴性，并且细菌内毒素检查用水溶解的内毒素系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反响终点浓度的几何平均值〔Es〕3/6/2025119五、凝胶法干扰试验正式干扰试验分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反响终点浓度的几何平均值〔Es〕和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素标准溶液的反响终点浓度的几何平均值〔Et〕Es=lg-1(ΣXs/4)Et=lg-1(ΣXt/4)当Es在０.5λ和２λ〔包括0.5λ和２λ〕及Et在0.5Es~2Es(包括0.5Es和2Es〕时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。3/6/2025120内毒素浓度2.0λλ0.5λ0.25λ内毒素/检查用水（系列溶液C）阴性对照（溶液D）内毒素/供试品溶液（系列溶液B）供试品阴性对照（溶液A）3/6/2025121内毒素浓度2.0λλ0.5λ0.25λ终点内毒素/检查用水（系列溶液C）阴性对照（溶液D）内毒素/供试品溶液（系列溶液B）供试品阴性对照（溶液A）

Es=lg-1(ΣXs/4)=λEt=lg-1(ΣXt/4)=1.41λλλ2.0λ2.0λλλλλ3/6/2025122五、凝胶法干扰试验内毒素浓度2λλ0.5λ0.25λ终点内毒素／检查用水++--λ〔系列溶液C)++--λ++--λ++--λ内毒素／供试品++--λ(系列溶液B)++--λ+---2λ+---2λEs=lg-1(ΣXs/4)=λEt=lg-1(ΣXt/4)=1.41λ3/6/2025123五、凝胶法干扰试验存在干扰的解决当存在干扰时，可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法〔过滤、中和、透析或加热处理等〕排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。3/6/2025124五、凝胶法干扰试验要求：当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时需进行干扰试验。要求使用３个批号以上的供试品，２个以上厂家的鲎试剂。仅当6次干扰试验均通过，方法学才成立。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时须重新进行干扰试验。3/6/2025125六、制定药品质量标准根据临床的用法用量计算出药品的细菌内毒素检查的限值，通过方法学研究确定样品对鲎试剂与内毒素的反响没有干扰作用，由此可以判定该品种可以用细菌内毒素检查法控制质量，并以此限值作为质量标准的内毒素限值。但同时还要考虑从严的原那么。参考国外药典标准。3/6/2025126实验根本流程图供试品限值确定最大有效稀释倍数确定供试品干扰实验

正式实验结果判断3个批号样品，2个鲎试剂厂家3/6/2025127内毒素限值没有考虑联合用药很多厂标要比限值严格在有些药典中内毒素限值被称为最大允许的内毒素浓度产品中允许的内毒素的量依赖于给药的剂量，剂量越大，单位内的内毒素限值越小一般确定的内毒素限值要保守〔严格〕一些3/6/2025128举例：１、注射用头孢哌酮钠，内毒素限值L=0.05EU/mg(按临床用药须知中每日最大量为12g，分2次注射。〕具体计算：L=K/M=5EU/kg÷6000mg/60kg=0.05EU/mg２、干扰浓度范围：Cmax=λmax/L=10mg/mlCmin=λmin/L=0.6mg/ml3/6/2025129举例3.干扰预实验：头孢哌酮有效浓度范围：10mg/ml-0.6mg/ml〔mg/ml〕1052.51.250.625供试品----------供试品阳性对照--++++++++〔建议使用较低灵敏度〔0.5或0.25EU/ml)鲎试剂，可尽量防止供试品所含内毒素对干扰实验造成的阳性结果〕,3/6/2025130举例最大不干扰浓度5mg/ml〔对应的鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml)4、正式干扰实验：(选用0.25EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂进行正式干扰实验〕配制含供试品浓度为5mg/ml的2λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素溶液。具体如下：取1支注射用头孢哌酮钠〔1.0g/支〕+10ml的BET水→100mg/ml取1ml〔100mg/ml〕+9mlBET水→10mg/ml取5ml〔10mg/ml〕+5mlBET水→5mg/ml3/6/2025131举例将内毒素配成1EU/ml的溶液备用。取1ml〔1EU/ml)内毒素溶液+1ml头孢哌酮溶液(10mg/ml)→2ml(0.5EU/ml,5mg/ml)取1ml〔0.5EU/ml,5mg/ml)+1ml(5mg/ml)→0.25EU/ml,5mg/ml取1ml〔0.25EU/ml,5mg/ml)+1ml(5mg/ml)→0.125EU/ml,5mg/ml取1ml〔0.125EU/ml,5mg/ml)+1ml(5mg/ml)→0.06EU/ml,5mg/ml取1ml〔0.06EU/ml,5mg/ml)+1ml(5mg/ml)→0.03EU/ml,5mg/ml3/6/2025132举例内毒素浓度 2.0λλ0.5λ0.25λ 〔0.5EU)(0.25)(0.125)(0.06)

内毒素/检查用水++++++++--------Es=0.25EU/ml〔系列溶液C〕

阴性对照〔溶液D〕-- 内毒素/供试品溶液++++++----------Et=0.35EU/ml〔系列溶液B〕

供试品阴性对照--〔溶液A〕 3/6/2025133举例：2.仿制药----已有质量标准热原检查改内毒素必须按临床用法用量计算L方法学研究已有内毒素标准非药典品种------必须方法学研究？L值不能松于原标准3/6/2025134七、中国药典收载细菌内毒素检查法的情况细菌内毒素检查法于1995年正式收载于中国药典，当时其格式及内容主要根据美国药典的内毒素检查法编写。2000年版药典又增加了?细菌内毒素检查法应用指导原那么?。3/6/2025135近年国外药典收载细菌内毒素

检查法的情况2000年前，美国、欧洲、日本三个国家的药典收载的细菌内毒素检查法方法各异，缺乏可比性。2000年1月3日国际协调委员会综合USP、EP、JP的方法，求同存异，出台了内毒素检查法的协调案。USP25、EP2002、JP14除保存少许特色外，方法内容和书写格式都趋于一致。3/6/20251362005版药典细菌内毒素检查法修订指导原那么2000版药典细菌内毒素检查法主要是根据24版美国药典制定的，与协调案后的细菌内毒素检查法存在很大差异。

为使我国细菌内毒素检查法与世界接轨，2005版药典中检查法的修改根本按照USP25、EP2002、JP14的统一格式，对于表达顺序、风格和内容等进行了较大的调整，保存了2000年版检查法的局部内容。3/6/20251372005版药典细菌内毒素检查法修订内容一、结构上的调整二、方法学上的修改三、细节描述上的修改

3/6/2025138

一、结构上调整3/6/2025139结构调整EP2002、USP25、JP14的表达是按试验步骤纂写的，容易理解，比较合理。各种溶液的配制采用表格形式表示，直观易懂。

2005版检查法改变2000版的表达方式，采用了与三国药典相同的表达顺序，以及表格的形式，这是两版药典细菌内毒素检查法区别最大的地方。3/6/2025140以凝胶限量试验溶液的制备为例编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2λ/供试品溶液2C2λ/检查用水2D无/检查用水2A：供试品溶液B：供试品阳性对照C：阳性对照D：阴性对照3/6/20251412000年版与2005年版药典内毒素检查法

整体结构

2000年版（分为检查法和指导原则）2005年版检查法简介（定义、标准品、检查用水试验准备鲎试剂灵敏度复核试验供试品的干扰试验细菌内毒素检查法（凝胶法和光度法）简介试验准备供试品溶液的制备细菌内毒素限值的确定确定最大有效稀释倍数（MVD）3/6/20251422000年版与2005年版药典内毒素检查法

整体结构

2000年版（分为检查法和指导原则）2005年版检查法结果判断方法一：凝胶法鲎试剂灵敏度复核干扰试验检查法：1）凝胶限量试验2）凝胶半定量试验

3/6/20251432000年版与2005年版药典内毒素检查法

整体结构

2000年版（分为检查法和指导原则）2005年版细菌内毒素检查法应用指导原则细菌内毒素限值的确定细菌内毒素定量测定法（浊度法和显色基质法）试验准备标准曲线的可靠性试验定量法的干扰试验供试品的定量测定方法二、光度测定法标准曲线的可靠性试验干扰试验光度法检查法3/6/2025144二、方法学上的修改

3/6/2025145方法学上的修改1、2000版药典中只收载凝胶法，定量法只作为指导原那么的一局部收载。2005版将2000年版的指导原那么合并入检查法中，正式收载细菌内毒素定量检测法〔光度法〕。3/6/2025146方法学上的修改2000年版2005年版修改原因

检查法为凝胶法指导原则中收载定量法。

两种方法：

凝胶法和光度测定法。可使用其中任何一种方法，当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。定量法发展日趋成熟，可以广泛使用，故将凝胶法和定量法合并收载。同时由于“凝胶法”和“光度法”是以检测原理命名，“定量法”是相对于“定性”的，所以，将“定量法”改为“光度测定法”更为妥当。3/6/20251472、增加了凝胶法半定量法

2000年版2005年版

修改原因

凝胶法为凝胶限量法：判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。凝胶法分为：凝胶限量试验判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。凝胶半定量试验本方法系通过确定终点浓度来量化供试品溶液中的内毒素的试验。虽然半定量法在我国使用不多，但是由于半定量法在其他国家应用广泛，许多进口药品的申报材料及进口复核都要求使用凝胶半定量法，所以添加此方法，与国际接轨。3/6/20251483、凝胶法干扰实验鲎试剂标示灵敏度对照系列保持4支2000年版2005年版修改原因

凝胶法干扰实验中：供试品对照管2支。鲎试剂标示灵敏度的系列每一浓度平行4支。凝胶法干扰实验中：供试品对照管2支。鲎试剂标示灵敏度的系列每一浓度平行4支。

协调案中要求供试品对照管4支，鲎试剂标示灵敏度的对照系列每一浓度平行2支试管。考虑到目前鲎试剂的质量各厂家存在差异。3/6/2025149编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液---2B2λ/供试品溶液供试品溶液12λ4

21λ4

40.5λ4

80.25λ4C2λ/检查用水检查用水12λ4

21λ4

40.5λ4

80.25λ4D无/检查用水---2表1凝胶法干扰试验溶液的制备3/6/20251504、将凝胶法中各种对照的数量由1支增加为2支

2000年版2005年版修改原因

凝胶法中：每批供试品需做2支供试品管，1支供试品阳性对照，1支阳性对照和1支阴性对照，共5支。

凝胶法中：每批供试品需做2支供试品管，2支供试品阳性对照，2支阳性对照和2支阴性对照，共8支。考虑到对照是试验是否成立的标准，所以将各种对照增加为2支。3/6/20251515、细化对细菌内毒素检查用水的要求

2000年版2005年版修改原因

检查法和应用指导原则中：细菌内毒素检查用水系指与灵敏度为为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。凝胶法细菌内毒素检查用水是指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素含量应小于0.005EU/ml。对检查用水提出更高的要求检查法分开，所以将检查用水分开要求。3/6/20251526、光度法试验中的几点改动

2000年版2005年版

修改原因

标准曲线的可靠性试验：用标准内毒素配成溶液并制成至少3个等比系列稀释液（稀释度为2~10），设为λ1、λ2……λn（n≥3）,其中λ1为标准曲线的最低内毒素浓度。标准曲线的可靠性试验：用标准内毒素配成溶液并制成至少3个浓度的稀释液（稀释度不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。由于制备标准曲线时不一定非是等比系列，所以去掉了对于等比系列稀释液的要求。另外，国际上对于光度法标准曲线中的各点浓度不再使用λ1、λ2……λn的概念，而只对其最低浓度称为λ。3/6/20251536、光度法试验中的几点改动

2000年版2005年版修改原因光度法的阴性对照规定为：

当阴性对照结果不超过λ1时，将全部数据进行线性回归分析。光度法的阴性对照规定为：

当阴性对照在设定的反应时间内不发生反应，将全部数据进行线性回归分析。使阴性对照控制更为严格。3/6/20251546、光度法试验中的几点改动

2000年版

2005年版

修改原因

光度法干扰试验中，在回收试验里添加的内毒素的量为：λm，λm为标准曲线中最低浓度λ1和最高浓度λn（n≥3）间的中间浓度

光度法干扰试验中，在回收试验里添加的内毒素的量为：标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为λm）。

因为考虑到标准曲线上的浓度数如为偶数则不存在中间点，因此改为“标准曲线的中点（或附近点）的浓度”，更为合理。3/6/2025155 三、细节描述上的修改3/6/20251561、由于2005年版药典将凝胶法与光度测定法同时收载，所以在简介中对凝胶法和光度法都进行了描述。并且也将两种方法的试验准备及限值确实定一同论述。3/6/20251572、由于2000版药典中对于细菌内毒素工作标准品的要求“细菌内毒素工作标准品中，每1ng细菌内毒素的效价应不小于2EU，不大于50EU〞为生产要求，并不针对用户，在2005版中删除对工作品的此项标准。3/6/20251583、因为考虑到供试品溶液中pH值等因素对试验的影响，故在2005版增加了“供试品溶液的制备〞项，并对供试品的pH值提出了要求。4、由于2005版将凝胶法与光度法一同收载，因此也将原来分开论述的最大有效稀释倍数〔M