2024-2025学年高二生物人教版选择性必修3同步练习 第3章 第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建

第2节基因工程的基本操作程序第1课时目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建课标内容(1)阐明基因工程的原理和基本操作程序。(2)尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。知识点1目的基因的筛选与获取1.培育转基因抗虫棉的四个步骤(1)目的基因的筛选与获取。(2)基因表达载体的构建。(3)将目的基因导入受体细胞。(4)目的基因的检测与鉴定。2.筛选合适的目的基因3.获取目的基因的方法4.利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。(2)基本条件(3)过程基于PCR的过程，完成下列问题：过程Ⅰ为变性，该阶段的温度为90__℃以上，目的是使双链DNA解聚为单链。过程Ⅱ为复性，该阶段的温度为50__℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。过程Ⅲ为延伸，该阶段的温度为72__℃左右，该过程需要在耐高温的DNA聚合酶的催化下，利用4种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则从子链的3′端延伸合成新的子链DNA。(4)仪器：PCR扩增仪(RCR仪)。(5)PCR产物的鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳。知识点2基因表达载体的构建1.构建基因表达载体的目的(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。(2)使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成3.基因表达载体的构建过程(1)首先用一定的限制酶切割载体。(2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。(3)再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。(1)从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。(√)(2)Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。(×)提示：Taq酶是耐高温的DNA聚合酶。(3)基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。(×)提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。(4)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚。(×)提示：不需要解旋酶。(5)DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。(×)提示：3′端。一、利用PCR获取和扩增目的基因【情境探疑】图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：(1)请完善图1中的信息。(2)高温变性的目的是使双链DNA解聚为单链。(3)PCR所需引物是依据目的基因的一段已知序列设计而成的，图1中引物A与引物B不同(填“相同”或“不同”)，其在PCR过程中不能(填“能”或“不能”)重复利用。(4)DNA复制时为什么需要引物？提示：在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此DNA复制时应加入两种引物。(5)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解解释)?提示：第3轮，如图所示：(6)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。提示：第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。(7)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？提示：要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。(8)如果循环n次，则共需消耗多少对引物？提示：共需消耗(2n－1)对引物。1.引物DNA复制时，DNA聚合酶不能从DNA模板链的一端直接开始合成子链，而是需要从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，形成DNA子链。因此进行PCR扩增的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列来合成引物。(1)引物的本质：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般是RNA片段。(2)引物的长度：用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。(3)一个PCR反应所需引物的种类：2种。DNA的两条链是反向平行的，2种引物要分别与两条模板链结合。2.PCR所需要的原料在PCR过程中实际加入的为dNTP，即脱氧核糖核苷三磷酸，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。其分子结构为：既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。3.生物体内DNA复制与PCR技术的比较【典例应用】例1下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是()A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对原则相同答案B解析DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。例2(2023·山东济宁高二检测)通过咽拭子取样进行RT－PCR技术检测是临床上诊断新冠病毒感染疑似患者的常用方法，用于核酸检测的RT－PCR试剂盒的部分工作原理简图如图所示：(1)RT－PCR是指以病毒的RNA为模板通过________过程合成cDNA，并对cDNA进行PCR扩增的过程。利用RT－PCR试剂盒对新冠病毒进行检测时，除借助上述RT－PCR技术外，还需要有特异性探针，利用该探针对新冠病毒进行核酸检测方法是____________。若用RT－PCR技术扩增胰岛素基因，应选择________细胞提取RNA。(2)PCR与体内DNA复制相比，不需要________酶。利用PCR技术扩增目的基因的前提是_________________________________________________________。(3)若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入________个引物。(4)PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是____________________________________________________________________。答案(1)逆转录PCR等技术胰岛B(2)解旋有一段已知目的基因的核苷酸序列作为模板，以便合成引物(3)211－2(4)延伸两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合解析(1)以RNA为模板合成cDNA的过程为逆转录过程，该过程需要逆转录酶的参与；探针是指被放射性同位素标记或荧光标记的一段单链核酸，因此制作该探针的依据是新冠病毒的核苷酸序列，利用该探针对新冠病毒进行检测的方法是PCR等技术。PT－PCR技术首先是以RNA为模板合成cDNA，因此应选择胰岛B细胞提取RNA。(2)PCR技术是利用DNA在高温条件下解开双链，因此与体内DNA复制相比，不需要解旋酶。利用PCR技术扩增目的基因的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列作为模板，以便根据这一序列合成引物。(3)PCR技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数即为新增单链数＝2·2n－2，因此，若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入2·210－2＝211－2个引物。(4)PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。用PCR可以扩增mRNA吗？提示：mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA—DNA杂交分子。②用一定的方法降解RNA—DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA，即cDNA。二、基因表达载体的构建【情境探疑】目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为限制酶和DNA连接酶。(2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割，原因是SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因。(3)构建基因表达载体时，可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA，但会导致目的基因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接等问题，为避免以上问题出现，应使用BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和Hind__Ⅲ)两种限制酶。(4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上启动子，其是RNA聚合酶识别和结合的部位。限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类(3)根据Ti质粒的T­DNA片段选择限制酶，下图中甲、乙、丁的Ti质粒均不宜选取，而丙的Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。【典例应用】例3(多选)某实验小组利用下图所示的质粒和目的基因来构建基因表达载体，将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述正确的是()A.图中的质粒用酶A切割后，会产生4个游离的磷酸基团B.在构建重组质粒时，可用酶A和酶C切割质粒和目的基因C.成功导入目的基因的大肠杆菌可在含四环素的培养基中生长D.若用酶B和酶C切割，可以避免质粒的自身环化答案AD解析限制酶每一次切割后会得到两个黏性末端，会有2个游离的磷酸基团，而图中的质粒含有2个酶A的切割位点，则会产生4个游离的磷酸基团，A正确；在构建重组质粒时，可用酶B和酶C切割质粒和目的基因，假如用酶A切割质粒会破坏两个标记基因，B错误；用酶B和酶C切割质粒时四环素抗性基因被破坏，成功导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长，C错误；用酶B和酶C两种限制酶切割可以避免目的基因和质粒自身环化和两者之间的反向连接等问题，D正确。例4(2023·天津滨海新区期末)下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是()A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别答案B解析启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等组件，B错误；人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达，C正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。例5(2023·天津滨海新区高二期末)基因工程中，需使用特定的限制性内切核酸酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GATC—，根据图示分析下列叙述正确的是()A.质粒用限制性内切核酸酶Ⅱ切割，目的基因用限制性内切核酸酶Ⅰ切割B.用限制性内切核酸酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解C.限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后获得的黏性末端不同D.质粒中标记基因的作用是便于筛选出目的基因已经表达的细胞答案B解析限制性内切核酸酶Ⅱ能识别限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列，限制性内切核酸酶Ⅰ不能识别限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列；要将目的基因从该DNA链中提取出来，需要在目的基因左右切开，所以要用限制性内切核酸酶Ⅱ；质粒不能用限制性内切核酸酶Ⅱ，若用该酶切割，质粒的两个标记基因均被破坏，A错误；由于DNA是双链，用限制性内切核酸酶Ⅱ将目的基因左右切开时，有四个磷酸二酯键被水解，B正确；限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割产生的黏性末端相同，C错误；质粒中标记基因的作用是用来筛选含有目的基因的受体细胞的，D错误。思维导图晨读必背1.PCR是聚合酶链式反应的缩写，该技术的原理是DNA半保留复制。2.PCR反应进行的条件有缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、温度条件等。3.PCR扩增的过程：变性→复性→延伸。4.在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，然后再用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶连接形成重组DNA分子。随堂检测1.下列关于PCR反应体系中所加物质作用的叙述，错误的是()A.耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成B.引物使TaqDNA聚合酶能从引物的5′端延伸DNA链C.目标DNA的双链用作合成DNA复制的模板D.四种脱氧核苷酸为PCR提供原料答案B解析通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链，A正确；在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，TaqDNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；PCR技术的原理是DNA半保留复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；DNA合成的原料是四种脱氧核苷酸，D正确。2.如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是()A.目的基因插入位点 B.启动子C.标记基因 D.DNA聚合酶识别位点答案B解析基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于基因的上游，所以X最可能是启动子，B正确。3.在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是()A.引物1与引物2 B.引物3与引物4C.引物2与引物3 D.引物1与引物4答案C解析要获得B链，根据PCR中子链延伸方向为5′到3′，则需选择引物2与引物3进行扩增，故选C。4.(2023·海南中学高三一模)PCR是聚合酶链式反应的缩写，下图表示PCR的过程，下列叙述错误的是()A.反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶在B过程起作用B.引物a和引物b的长度应适宜，且相互之间不能发生碱基互补配对C.PCR是体外进行的DNA扩增，PCR扩增遵循DNA半保留复制原则D.A过程通过高温破坏DNA分子中的氢键，使双链DNA解聚为单链答案A解析反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶的作用是催化合成DNA子链，在C过程中起作用，A错误；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，且引物之间不能发生碱基互补配对，否则引物之间会配对形成双链核酸从而失去作用，B正确；PCR是体外进行DNA扩增的技术，根据题图可知，PCR扩增遵循DNA半保留复制原则，C正确；A过程为DNA变性过程，该过程通过高温破坏DNA分子中的氢键，当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，D正确。5.(多选)(2023·辽宁六校联考)DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体产生免疫应答。可选择的限制酶分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析正确的是()A.构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒B.若用EcoRⅠ切割质粒，产生的DNA片段具有黏性末端C.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，会产生多种连接产物D.图乙质粒用EcoRⅠ切割前后，分别含有2个和4个游离的磷酸基团答案ABC解析分析题图，外源DNA分子和质粒上都含有3种限制酶(BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ)的切割位点，为了防止目的基因和质粒自身环化和两者之间的反向连接，构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒，A正确；EcoRⅠ切割后获得的是黏性末端，B正确；用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，能产生多种连接产物，如目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因与质粒正向连接、目的基因与质粒反向连接等，C正确；图乙质粒用EcoRⅠ切割前为环状DNA分子，不含游离的磷酸基团，切割后为链状DNA分子，含有2个游离的磷酸基团，D错误。eq\a\vs4\al(课时精练)(时间：30分钟)【基础对点】知识点1目的基因的筛选与获取1.实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增，下列相关叙述错误的是()A.PCR反应中目的基因呈指数形式扩增B.反应过程包括变性→复性→延伸C.90℃以上时双链DNA的氢键断开D.引物与模板结合后向引物的5′端方向延伸DNA链答案D解析引物与模板结合后向引物的3′端方向延伸DNA链，D错误。2.(2023·北京市十一中学期中)用PCR扩增下面的DNA片段：5′GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG3′3′CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC5′供选择的引物有：①5′GACCTGTGGAAGC3′②5′CATACGGGATTG3′③5′GTATGCCCTAAC3′④5′CAATCCCGTATG3′共四种，应选择()A.①② B.②③C.③④ D.①④答案D解析用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，耐高温的DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端至3′端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5′端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5′端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5′端的碱基序列是5′GACCTGTGGAAGC和5′CAATCCCGTATG，故对应的引物为①5′GACCTGTGGAAGC3′和④5′CAATCCCGTATG3′，D正确，A、B、C错误。3.下列关于PCR的叙述，正确的是()A.PCR是体外复制DNA技术，关键酶是解旋酶和DNA聚合酶B.DNA聚合酶从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸C.第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段D.延伸过程需要酶、ATP和4种核糖核苷酸答案C解析PCR体外复制DNA不需要解旋酶，需要耐高温的DNA聚合酶，A错误；DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，B错误；第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段，C正确；PCR是在较高温度条件下进行的，该过程需要耐高温的DNA聚合酶，且PCR反应的产物是DNA，因此原料是4种游离的脱氧核苷酸，不是核糖核苷酸，D错误。4.下列有关获取目的基因的叙述错误的是()A.目的基因就是编码蛋白质的基因B.筛选和获取目的基因是基因工程的第一步C.来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会答案A解析目的基因主要是指编码蛋白质的基因，A错误；目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第一步，B正确；来自苏云金杆菌的Bt基因可作为培育转基因抗虫棉用到的目的基因，C正确；随着测序技术的发展，以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正确。5.(2021·湖北卷，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是()A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度答案D解析PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。知识点2基因表达载体的构建6.(2023·黑龙江齐齐哈尔期中)基因工程的核心是构建基因表达载体，下列不属于载体作用的是()A.载体能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”B.载体能协助目的基因在受体细胞中复制C.载体含有启动子和终止子协助目的基因表达D.载体具有标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞答案A解析载体不能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”，A错误；载体在受体细胞中能够稳定存在，并且自我复制，使目的基因数量扩大，B正确；启动子是RNA聚合酶的识别和结合的位点，能启动转录过程，终止子控制着转录的结束，所以载体含有的启动子和终止子可协助目的基因的表达，C正确；载体具有标记基因，标记基因便于筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。7.(2022·广西柳州一中月考)下列关于基因表达载体的说法，错误的是()A.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤B.基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等C.终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程D.不同的目的基因所需的启动子不一定相同答案C解析基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段DNA片段，终止子位于目的基因的下游，能够终止转录过程，B正确，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。8.(2023·黑龙江哈尔滨期末)蜘蛛丝是天然蛋白纤维，其机械性能高于常用于制作防弹衣的凯夫拉纤维，有广泛的应用前景。近期，中国科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是()A.为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因B.构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达C.启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，可以驱动遗传信息的复制和转录D.基因表达载体中的标记基因可以鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞答案C解析用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因，可以使目的基因两端产生不同的黏性末端，防止目的基因自身环化，A正确；为能从蚕丝腺细胞中提取蛛丝蛋白，基因表达载体中目的基因的上游必须含有使其能在蚕丝腺细胞中转录的启动子，即构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达，B正确；启动子只能驱动基因转录，不能驱动其复制，C错误；基因表达载体中的标记基因的作用是鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞，D正确。9.(2023·南师附中期初)载体是基因工程中携带外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述错误的是()A.重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体B.载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因C.必须把目的基因插入重组载体A的启动子和终止子之间D.培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上有明显差异答案C解析重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A正确；作为运载体必须要具备的条件有：含有限制酶的切割位点(便于目的基因的插入)、复制原点(便于目的基因的扩增)及标记基因(便于筛选含有目的基因的受体细胞)等，因此载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因，B正确；培养细菌A的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A的启动子和终止子之间，C错误；培养细菌A的目的是扩增目的基因，培养细菌B的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D正确。【综合提升】10.(2023·河南商丘联考)PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。下列有关PCR技术的叙述正确的是()A.打开DNA双链需依赖解旋酶B.子链延伸的方向是3′端→5′端C.所用的引物一定是单链DNA分子D.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行答案D解析在PCR技术中，DNA的解旋是通过控制温度实现的，超过90℃，双链DNA解聚，A错误；DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；引物可以是单链DNA分子，也可以是单链RNA分子，C错误；PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，PCR反应的缓冲溶液的作用是给PCR体系提供一个最适反应条件，D正确。11.(多选)下列有关PCR与体内DNA复制的叙述，正确的是()A.都属于半保留复制B.都需要DNA聚合酶和DNA连接酶C.所需的酶在相同温度下活性不同D.PCR需要一小段人工合成的DNA或RNA做引物答案ACD解析PCR过程中两条链是单独、连续合成的，不像体内DNA复制时，两条子链在同一复制叉中合成，一条链不连续，所以PCR过程不需要DNA连接酶，B错误。12.(2023·北京朝阳区模拟)PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶酶切位点等。下列叙述正确的是()A.该图表示PCR循环中的变性环节B.dNTP作为扩增的原料会依次连接到5′端C.耐高温的DNA聚合酶催化相邻的两个dNTP之间形成磷酸二酯键D.用图中引物扩增两个循环后即可获得两端添加限制酶酶切位点的产物答案C解析图中引物与模板链碱基互补配对，该图表示PCR循环中的复性环节，A错误；DNA聚合酶只能催化脱氧核苷酸连接在3′端，所以dNTP作为扩增的原料会依次连接到3′端，B错误；延伸时，在耐高温的DNA聚合酶催化下，相邻的dNTP间形成磷酸二酯键，C正确；由于两个引物均不在该片段的端点，因此第一轮循环后得到的两个DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长，第二轮中亦不会出现两条链等长的目的DNA片段，在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，所以第三轮循环后可获得两端添加限制酶酶切位点的目的产物，D错误。13.(多选)(2023·山东临沂高三检测)某人利用下图中所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组表达载体。下列有关叙述正确的是()A.这三种重组表达载体中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的是甲、丙B.启动子是DNA片段，是RNA连接酶识别和结合的部位C.抗生素抗性基因便于重组DNA分子的筛选D.复制原点可以让重组表达载体拥有自主复制的能力，不会随细胞分裂被稀释而最终消失答案ACD解析在基因表达载体中，启动子位于目的基因的前面，终止子应位于目的基因的后面，这样基因才能表达，图中甲和丙均不能在宿主细胞内表达目的基因产物，A正确；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，它能驱动基因转录出mRNA，B错误；载体上的标记基因便于重组DNA分子的筛选，该载体上的标记基因是抗生素抗性基因，C正确。14.(多选)聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR引物的叙述正确的是()A.为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列B.为了便于将扩增的DNA片段与载体连接，可在引物的3′端加上限制酶识别序列C.在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化D.复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关答案ACD解析引物之间不应存在互补序列，否则会出现引物与引物配对情况，降低PCR的效率，A正确；引物引导子链合成的方向是5′端→3′端，因此为了便于将扩增的DNA片段与载体连接，需要在引物的5′端加上限制酶识别序列，B错误；为了便于扩增的DNA片段与载体连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别位点，主要目的是使目的基因能定向插入表达载体，避免目的基因自身环化，C正确；复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关，D正确。15.基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是______________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的__________。(2)目前在PCR反应中不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是__________________。(3)含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶，这两种酶对DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰，使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。含有某种限制酶的细胞，可以利用限制酶切割外源DNA，但不破坏细胞自身的DNA，其原因可能有：①________________________________________________________________________________________________________________________________________；②________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)利用PCR扩增目的基因的过程由高温变性(90℃以上)、低温复性(50℃左右)、适温延伸(72℃左右)三个步骤构成一个循环，为使得DNA聚合酶能够重复利用，选用的酶应在__________________________