出口化妆品中病原菌检测方法 微滴式数字PCR法 第10部分：嗜麦芽窄食单胞菌_第1页
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1SN/T5760.10—2进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR法第10部分：嗜麦芽窄食单胞菌本文件描述了进出口化妆品中嗜麦芽窄食单胞菌的微滴式数字PCR检测方法。本文件适用于进出口化妆品中嗜麦芽窄食单胞菌的快速检测。本文件所能达到的检出限(LODm)为0.69CFU/g(mL)-6.85CFU/g(mL)。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最忻版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T2206.13化妆品微生物检验方法第13部分：嗜麦芽窄食单胞菌SN/T5075化妆品微生物检验副样规范3术语和定义本文件没有需要得定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonueicAcid)dAPCR:微滴式数字PCR(dropletdigitalPdyineraseChainReaction)PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)5方法原理针对嗜麦芽窄食单胞菌16SrRNA编码基因设计引物、探针，将一定浓度的引物、探针与模板DNA及反应预混液混合，配成PCR反应体系。将该数字PCR体系分布到12000个-20000个微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子的数量为1或0,然后进行PCR扩增。16SrRNA基因探针5'端标记FAM荧光基团，3'端标记BHQI。利用数字PCR系统的检测通道，可对每个微滴的荧光信号进行采集分析。含有模板DNA的微滴出现荧光信号的增强。形成阳性微滴簇。最终根据阳性微滴的有无判定样品中是否含有嗜麦芽窄食单胞菌。吸取10mL1:10样品稀释液接种到90mLSCDLP增菌液中，置于30℃±1℃培养箱培养时，用生理盐水清洗沉淀1次-2次。用1mL生理盐水混悬沉淀，于10000g-12000g离心3min,弃去上清液。在沉淀中加入50pLDNA提取液振荡混匀，于95℃-100℃加热10min,室温冷却4按照公式(1)计算DNA的浓度。

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