一氧化氮（NO）含量检测试剂盒实验解决方案

一氧化氮（NO）含量检测试剂盒实验解决方案原理NO（NitricOxide，NO）广泛分布于生物体内神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统中，特别是神经组织中较丰富。它作为细胞间及细胞内的信息物质，发挥信号传递的作用，是一种新型的生物信使分子，在机体的生理、病理过程中起着重要的作用。NO易被氧化成亚硝酸盐和硝酸盐，因此，通常要测定亚硝酸盐和硝酸盐的总量来推算出总的一氧化氮的量。CheKine™一氧化氮（NO）含量检测试剂盒（微量法），采用改进的格里斯法将硝酸盐还原为亚硝酸盐后，即可准确测定NO的生成量。格里斯分析的机理概括为重氮类之间的偶氮耦合，重氮类是由磺胺和NO2-和N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐产生的，产生与NO代谢物成正比的比色（540nm）产物。自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光值）·恒温培养箱·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·去离子水、PBS(pH7.4)·匀浆器（如果是组织样本）试剂准备NaNO2Standard(1M):使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；分装避光保存于-20℃。GriessReagentI：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。GriessReagentⅡ：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。VCl3Reagent：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。ZnSO4：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。标准曲线设置：取10µLNaNO2Standard(1M)用990µLPBS(pH7.4)稀释至10mMNaNO2Standard储备液Ⅰ。取10µL10mM的NaNO2Standard储备液Ⅰ用990µLPBS(pH7.4)稀释至100µMNaNO2Standard储备液Ⅱ。用100µMStandard储备液Ⅱ按下表所示，进行下一步稀释：序号100µMStandard储备液Ⅱ(μL)PBS(pH7.4)(μL)浓度(µM)Std.12000100Std.210010050Std.34016020Std.42018010Std.5101905Std.641962Std.721981Blank02000注意：标准品现配现用；稀释后的标准溶液不稳定，必须在4小时内使用。样本制备动植物组织或细胞样本：称取约0.1g组织样本或收集500万个细胞，加入1mLPBS(pH7.4)，冰浴匀浆，14,000rpm，4℃离心10min，取上清液待测。血浆，血清和尿液（和其他生物体液）：直接将样品加入96孔板或微量玻璃比色皿。需要进行去蛋白的样品包括血清、血浆、全血、含有FBS的细胞培养基、组织或细胞裂解物。尿液和唾液不需要脱蛋白。脱蛋白处理：将150μL样品与8μLZnSO4混合在1.5mLEP管中，旋涡，然后14,000rpm，4℃离心10min。将100μL的上清液转移到干净的EP管中。注意：建议您使用新鲜样品，如果不立即实验，样品可在-80℃保存一个月。如果样品需要脱蛋白，则每种标准品应制备150μL，并同样用硫酸锌处理，避免结果计算中需要使用稀释因子。抗氧化剂和亲核剂（例如β-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇和半胱氨酸）可能会干扰检测。在样品制备过程中避免使用这些化合物。实验步骤酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计用去离子水调零。工作液的配制：每孔需要200μL工作液，为避免损失，按204µL每孔体系配制：吸取104μLVCl3Reagent，50μLGriessReagentⅠ和50μLGriessReagentⅡ。工作液需现配现用。将100μL稀释的标准品和样品添加到单独标记的EP管中（建议样品至少重复测量2次）。然后在每个样品和标准管中加入200μL工作液，混合均匀。将反应体系在37℃下孵育30min。对反应管进行短暂离心以去除不溶物，并将每个反应体系中分别取250μL液体转移到96孔板或微量玻璃比色皿中。在540nm处读取A值，分别标记为ABlank,AStandard和ASample。所有A值减去空白孔A值，计算ΔAStandard=AStandard-ABlank,ΔASample=ASample-ABlank。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本A值>1.0，则说明样本NO含量太高，需用PBS（pH7.4）适当稀释（计算公式中乘以相应稀释倍数）。如果样本的ΔASample低于0.005，可提高样本量。结果计算以标准液浓度为x轴，ΔAStandard为y轴，绘制标准曲线。将ΔASample带入方程得到x值（µM）即NO含量。换算：1mg/dLNO相当于333μM，0.001%或10ppm。结果展示典型标准曲线：以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。ΔA540ΔA540[NO](μM)Figure1.96孔板分析的NO标准曲线相关产品CatalogNo.ProductNameKTB1010CheKine™辅酶ⅡNADP(H)含量检测试剂盒（微量法）KTB1020CheKine™辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒