义翘讲堂《成药性抗体开发：从抗原设计到功能活性评价的全流程解析》

成药性抗体开发：从抗原设计到功能活性评价的全流程解析任为抗体开发首席科学家北京义翘神州科技股份有限公司功能活性亲和力检测表位分析生物安全检测高通量/大规模生产稳定株开发人源化改造亲和力成熟蛋白免疫RNA免疫DNA免疫细胞免疫杂交瘤技术噬菌体技术流式分选技术Beacon®技术抗原制备及免疫抗体制备及筛选抗体工程化及生产抗体功能评价综合性抗体开发平台抗原制备和动物免疫01HEK293/CHO膜蛋白InsectE.coli8,000+高质量现货蛋白85%真核细胞表达100%自主研发2,000多种生物活性检测和分析方法CRO定制服务数量>15,000个覆盖常见药物靶点>80%好的抗原是成功的一半重组蛋白类免疫原高纯度、高活性、高亲和力重组蛋白，支持高质量抗体的研发亲和力HumanTROP-2(Cat:10428-H08H)KD:1.64nM活性EC50:1.6-4.8ng/mLHumanGSK3β(Cat:10044-H07B)SEC-HPLC纯度>90%Claudin6(跨膜蛋白)KD:0.536nMEC50:5.4ng/mLCynoTROP-2(Cat:90893-C08H)亲和力活性亲和力活性EC50:1.3-3.9ng/mLKD:1.53nMEC50:0.8ng/mLMouseTROP-2Claudin18(跨膜蛋白)活性纯度活性EC50:0.15-0.35μg/mL活性重组蛋白类免疫原多肽抗原制备特定表位抗体亲水性、溶剂可及性免疫原性多肽二级结构、柔韧性AlphaFold结构预测多肽免疫成功开发特异性磷酸化抗体开发多肽设计软件，有效提高抗体开发成功率多肽类抗原免疫效价好，更易获得与天然构象蛋白结合的抗体mRNA免疫支持膜蛋白抗体开发序列设计mRNA合成LNP包封动物免疫抗体筛选仅需提供蛋白序列；RNA-LNP方式递送，免疫应答效果好;整体开发周期短、成本优势；适用于各类型单抗筛选平台。mRNA-LNP免疫案例——GPRC5D靶点杂交瘤融合筛选获得38株阳性克隆，其中含25株流式优势抗体mRNA免疫17000+不同类型抗原的免疫经验佐剂储备库弗氏佐剂、铝佐剂、MF59、QS21Titermax、Mn、MPL

多种属及品系可选小鼠（BALB/c，C57BL/6,SJL）【兔、羊驼、山羊、鸡等】动物数量根据项目难度综合评估、灵活选择免疫剂量根据免疫原性、抗原类型、亲和力要求调整免疫途径皮内、皮下、腹腔、静脉、淋巴结、脾内免疫周期满足不同时效项目要求常规（7~12周）、快速（3周、5周）免疫方案设计动物免疫抗体开发和技术优化02杂交瘤噬菌体展示文库B细胞流式高质量的候选抗体：数百个苗头分子亲和力达到nM-pM水平适用于不同应用场景成药性抗体制备技术平台B细胞Beacon®抗体制备技术平台介绍高效的抗体开发技术平台：最全面的技术路线多种早期介入筛选方案分步的抗体开发技术优化YYYYYYYYYYYYYYYYYSplenocytesMyelomaHybridomacellsScreeningAmplification&purification杂交瘤抗体开发技术技术路线成熟，成本优势；电融合技术大幅提升融合效率；上清介入多功能筛选，提高成功率；自主开发鼠单抗数量>20,000种700+技术服务项目经验杂交瘤技术活性蛋白免疫细胞活性等多功能介入筛选13株亚克隆细胞稳定株102株主克隆ELISA竞争抑制阳性(抽检20株，6株细胞活性阳性）重组蛋白（细胞生物活性检测EC502~8ng/mL）15株亚克隆ELISA竞争阳性40株细胞2~3轮有限稀释835孔主克隆ELISA结合阳性融合后细胞接种42块96孔细胞培养板10只小鼠高效价，挑选1只进行融合Balb/c、C57BL/6小鼠各免疫5只抗体亲和力达到E-10级别IL15中和抗体开发案例杂交瘤技术13株抗体均可抑制细胞，其中11株优于对照抗体抗体亲和E-10~E-11MKD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)2.29E-103.91E+058.94E-05Response(nm)Response(nm)MM03HMM11HMM12HResponse(nm)Positivecontrol杂交瘤技术IL15中和抗体开发案例KD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)2.47E-101.97E+054.88E-05KD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)8.78E-114.15E+053.64E-05杂交瘤融合&主克隆筛选阳性克隆有限稀释提基因质控交付：细胞株、抗体、序列亚克隆筛选表达纯化生产纯化周期节省20-30天20-30天14天7天7天新路线传统路线技术路线对比新一代杂交瘤技术ID主克隆检测亚克隆检测主克隆提基因结果提基因与主克隆检测对比1阳性-复测亚型为mIgM放弃mIgG1-阴性一致mIgM-阳性2非竞争，弱IgM,IgG弱交叉竞争非竞争，IgG弱交叉一致3非竞争，弱IgM,IgG弱交叉竞争非竞争，IgG弱交叉一致4非竞争，IgG弱交叉非竞争，IgG交叉非竞争，IgG弱交叉一致5非竞争，IgG弱交叉非竞争，IgG交叉非竞争，IgG弱交叉一致6非竞争，IgG交叉IgG无交叉非竞争，IgG弱交叉一致7非竞争，IgG弱交叉非竞争，IgG交叉非竞争，IgG弱交叉一致8ELISA阳性，流式阳性ELISA阳性，流式阴性ELISA阳性，流式阳性一致9ELISA阳性，流式阳性ELISA阳性，流式阴性ELISA阳性，流式阳性一致10ELISA阳性，流式阳性ELISA阳性，流式阴性ELISA阳性，流式阳性一致11ELISA阳性，流式阳性ELISA阳性，流式阴性ELISA阳性，流式阳性一致12ELISA阳性，流式阳性ELISA阳性，流式阴性ELISA阳性，流式阳性一致13ELISA阳性，流式阳性ELISA阳性，流式阴性ELISA阳性，流式阳性一致14ELISA阳性，流式阳性ELISA阳性，流式阴性ELISA阳性，流式阳性一致15ELISA阳性，流式阳性ELISA阳性，流式阴性ELISA阳性，流式阳性一致16ELISA阳性，流式阳性ELISA阳性，流式阴性ELISA阳性，流式阳性一致17ELISA阳性，流式阳性ELISA阳性，流式阴性ELISA阳性，流式阳性一致18非竞争，IgG弱交叉非竞争，IgG交叉ELISA阴性不一致19非竞争，IgG弱交叉二亚转阴ELISA阴性不一致20ELISA阳性，流式阳性ELISA阳性，流式阴性ELISA阴性不一致21非竞争一亚转阴ELISA阴性不一致21株有问题细胞，17株提基因结果与主克隆一致，成功率80%主克隆提基因验证案例新一代杂交瘤技术周期更短直接交付序列通量更高成功率更高比原有杂交瘤周期节省20-30天提基因替代有限稀释，一次提取上百个克隆省去杂交瘤筛选后再提基因步骤，避免基因传代丢失、污染等风险挽救亚克隆转阴或与主克隆结果不一致的细胞克隆新一代杂交瘤技术平台优势更好面向工业客户药筛客户新一代杂交瘤技术筛选方法多样：固相、液相、细胞筛选；筛选策略灵活：差减、竞争、交叉、夹心；克隆上清介入评价：流式、ELISA、交叉。3,000+株单抗产品；支持多种应用：FACS、WB、IHC、IF抗体；保证高亲和力、特异性抗体；新冠中和抗体亲和力达E-12M，销售总量＞800mg。建库淘筛产品服务丰富的CRO服务经验：500+服务；5~6周完成建库、筛选和分子构建；提供多种抗体服务：抗独特型抗体、中和抗体、纳米抗体、

抗体亲和力成熟。天然库和免疫库，多种免疫方案；多种属：小鼠、兔子、羊驼、人；免疫库的库容高达109以上，序列插入正确率高达100%。噬菌体展示技术噬菌体展示技术筛选CAR-T靶点案例与天然构象结合最好用蛋白+细胞免疫，噬菌体平台更适合scFv(CAR)筛选Nalm-6cellsJurkatcellsHEK293cellsscFv-1scFv-2scFv-3部分scFv鉴定结果噬菌体展示技术蛋白+细胞免疫细胞淘洗ELSIA阳性127株Nalm-6强阳性48株与293过表达和Nalm-6均结合，与jurkat不结合筛选要点CH2CH3CH2CH3FR1FR2FR3FR4CDR1CDR2CDR3VHH

效价达到128K，阳性/blank>2倍

库容达到109

插入率100%，测序正确率>90%噬菌体介入检测ELISA、种属交叉、FACS

至少交付20+独特序列

亲和力主要在10-8~10-9

cell-free表达，5天得到VHHBloodCollectionRT-PCRConstructalibraryBiopanningElutionExpressionSDSActivityAffinityVHHELISA纳米抗体开发平台噬菌体展示技术PD-L1纳米抗体筛选亲和力检测

SampleIDIC50(μg/mL）EC50(μg/mL）Benchmark10.144260.38Benchmark20.14190.33Nh3940.083440.23Nh4840.107230.51SampleIDKD(M)Kon(1/MS)Koff(1/S)Benchmark16.60E-096.96E+044.59E-04Benchmark26.37E-101.82E+051.16E-04Nh3941.44E-091.01E+051.45E-04Nh4843.42E-091.75E+055.98E-04Benchmark1Benchmark2Nh394Nh484噬菌体展示技术活性检测

竞争活性

细胞活性单B细胞技术路线种属适用范围广天然抗体对抗体多样性高开发周期短抗体亲和力高操作要求高

依赖大型设备VHDJHCY1VKJKCK单个B细胞技术Beacon®BDFACSAriaIIISplenocytes&PBMCSingleBCellSortingRT-PCR&InsertVectorExpressionFunctionAssayBCellCulture流式分选单B细胞技术VH/VL配对成功率达业内领先水平兔单B细胞培养阳性率高天然抗体序列抗体多样性好可进行全人源抗体筛选Starkie,D.O.,etal.PLoSONE,2016,11(3):e0152282.Wilson,J.R.,Virology,2014,458-459:114–124.SeeberS.,etal.PLoSONE,2014,9(2):e86184.Chen,Y.,etal.EmergingMicrobes&Infections,2021,10(1),1390–1403.流式分选单B细胞技术BCellLysis成药性抗体开发案例流式分选单B细胞技术靶点蛋白与多个因子相互作用并参与三个不同信号通路调控，筛选难度大筛选目标通路1通路2通路3靶点蛋白靶点蛋白靶点蛋白因子A因子C因子D因子E因子F因子B人猴交叉三个信号通路上同时阻断六个细胞因子与靶点蛋白结合的抗体阻断活性好于对照药物24技术路线免疫原制备对照抗体表达纯化、细胞系制备、细胞活性方法建立血清效价检测（ELISA、FACS、竞争活性）流式单B分选分选阶段：荧光标记抗原结合；培养上清：抗原/细胞结合、种属交叉检测质控阶段：抗原结合、细胞结合、细胞活性、亲和力检测兔子免疫

常规免疫淋巴结铝佐剂人鼠猴混合免疫人鼠交叉免疫人鼠猴交叉长周期免疫血清效价>62.5万√√√√√√兔子免疫IgGFSC抗原抗原IgMSSC同时开展>6种免疫方案，有效增加抗体的多样性多只动物效价良好，可满足分选要求分选阳性细胞比例流式分选单B细胞技术成药性抗体开发案例免疫原再刺激注：红色箭头指阳性对照抗体免疫原再刺激亲和力检测Ligandka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)Chi²(RU²)U-value对照抗体9.631E+055.337E-055.542E-110.06991R04018.083E+051.022E-041.265E-100.1211R03897.810E+057.231E-059.259E-110.08241R03711.095E+065.356E-054.893E-110.161R03668.800E+053.043E-053.458E-110.05272R03221.77E+069.31E-055.27E-110.05251对照抗体R0401R0389R0371R0366R0322流式分选单B细胞技术与人细胞结合与猴细胞结合成药性抗体开发案例注：红色箭头指阳性对照抗体流式分选单B细胞技术成药性抗体开发案例SampleIC50(ng/mL)R0322/R037121R036616R038939R040139对照抗体

24SampleIC50(ng/mL)R0322/R037154R036619R038981R040174对照抗体

37SampleIC50(ng/mL)R04151106R0411562R0408/R0389157R0366186对照抗体

459成功筛选到在三个信号通路上活性均不低于对照抗体、且亲和力好的单抗分子SampleIC50(ng/mL)R032230R037145R036624R038958R040173对照抗体

27SampleIC50(ng/mL)R03229R037124R036612R038928R040153对照抗体

18SampleIC50(ng/mL)R032212R037131R036626R038966R040168对照抗体

21信号通路1因子A与靶蛋白的阻断活性信号通路1因子B与靶蛋白的阻断活性信号通路2因子C与靶蛋白的阻断活性信号通路3因子D与靶蛋白的阻断活性信号通路3因子E与靶蛋白的阻断活性信号通路3因子F与靶蛋白的阻断活性27Beacon®光导单B细胞克隆技术ImmunizationandASCEnrichmentNanopenLoadOEPGravityIn-ChannelFluorescent”Bloom”AssayOEPNanopenExportVH/VLrecovery,cloning,expression30-60minutes30-60minutes3-4minutesperNanopenImportExport天然抗体序列；抗体多样性好；实验周期短，节省研发时间；高效筛选，1天内可完成高达5种功能检测；非竞争竞争非竞争竞争通过技术优化，有效提高beacon®竞争检测灵敏度竞争方法优化Beacon®光导单B细胞克隆技术编号人蛋白猴蛋白EC50(ng/mL)M010135.1334.39M0121154.33110.37M01667.326.51NBL-02028.506.08LBL-01920.107.73编号IC50(ng/mL)M0101357.14M01211644.20M016667.42NBL-020169.44TNFR2成药性抗体筛选1.克隆M0166结合活性和竞争活性均好于对照抗体Beacon®光导单B细胞克隆技术与人TNFR2结合竞争活性与猴TNFR2结合编号细胞活性ED50(μg/mL)ADCC活性ED50(ng/mL)M01011.321.53M01211.113.26M01660.73.96NBL-0201.25.84LBL-0191.319.752.克隆M0166细胞活性和ADCC均好于对照抗体编号蛋白KD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)M0101人蛋白3.68E-092.70E+059.93E-04M01216.84E-092.70E+051.85E-03M01665.35E-091.74E+059.33E-04NBL-0207.73E-092.69E+052.08E-03M0101猴蛋白3.18E-093.90E+051.24E-03M01216.39E-094.30E+052.75E-03M01663.75E-092.79E+051.05E-03NBL-0205.22E-094.39E+052.30E-033.克隆M0166亲和力检测结果Beacon®光导单B细胞克隆技术细胞活性ADCC活性GPRC5D-NanoDisc蛋白筛选抗体GPRC5D结构VLP平台Nanodisc平台Beacon®光导单B细胞克隆技术VLP平台Nanodisc平台EC50:3-10ng/mLEC50:20.6ng/mLEC50(ng/mL)M0165M0173对照抗体GPRC5D-VLP1.682.736.88GPRC5D-Disc2.233.535.33细胞结合1.5472.1682.835ADCC0.550.831.51.在与GPRC5D-VLP和GPRC5D-Disc的结合检测上，M0165和M0173结合活性均优于对照抗体2.M0165和M0173细胞结合和ADCC杀伤活性均优于对照抗体IDkon(1/Ms)kdis(1/s)KD(M)对照抗体4.91E+055.24E-041.07E-09M01651.98E+062.85E-041.44E-10R01734.03E+054.15E-041.03E-093.M0173亲和力与对照抗体亲和力水平相当，M0165亲和力比对照抗体约高10倍细胞结合ADCCBeacon®光导单B细胞克隆技术GPRC5D-VLP结合GPRC5D-Disc结合生物活性(EC50)亲和力检测抗体生产和工程化改造03优势：方法成熟，临床疗效良好问题：仍有亲和力降低或潜在的免疫原性抗体人源化方法

–CDR移植CDR移植FR替换核心氨基酸保留CDR亲本抗体FR人源抗体FR核心氨基酸抗体人源化TargetIDConc.(mg/L)HumannessSars-Cov2-SpikeMM57-C1-mAb249.5/MM57-C2-chAb141/MM57-436597%MM57-624897.4%MM57-1316596.10%MM57-1419097%MM57-1519897.4%MM57-1810097%MM57-2510697.8%MM57-3017397.8%MM57-3418497.8%MM57-3826797.8%mAb_humanized_VLmAb_humanized_VH抗体人源化鼠抗人源化案例表达量和同源性MM57-C1-mAb:亲本鼠抗；MM57-C2-chAb:人鼠嵌合抗体。mAb_VLmAb_VHTargetIDInhibition(%)IC50(μg/ml)(Pseudovirus)Sars-Cov2-SpikeMM57-C1-mAb87%0.548MM57-C2-chAb85%0.341MM57-487%0.268MM57-685%0.685MM57-1381%<0.1MM57-1480%0.41MM57-1581%0.375MM57-1876%0.148MM57-2572%0.458MM57-3074%0.784MM57-3474%0.307MM57-3875%0.438鼠抗人源化案例抗体人源化中和活性检测MM57-C1-mAb:亲本鼠抗；MM57-C2-chAb:人鼠嵌合抗体。TargetIDKD(M)Kon(1/Ms)Koff(1/s)Sars-Cov2-SpikeMM57-C1-mAb1.74E-103.30E+055.74E-05MM57-C2-chAb2.51E-112.79E+056.99E-06MM57-47.52E-122.01E+051.51E-06MM57-6<1.0E-121.91E+05<1.0E-07MM57-13<1.0E-121.91E+05<1.0E-07MM57-14<1.0E-121.89E+05<1.0E-07MM57-154.31E-112.16E+059.30E-06MM57-182.83E-111.73E+054.89E-06MM57-254.85E-112.17E+051.05E-05MM57-301.38E-101.92E+052.65E-05MM57-349.54E-112.07E+051.98E-05MM57-388.53E-111.98E+051.69E-05抗体人源化鼠抗人源化案例亲和力检测MM57-C1-mAb亲本鼠抗MM57-C2-chAb嵌合抗体MM57-4MM57-6MM57-13MM57-14MM57-15MM57-18MM57-25MM57-34MM57-38MM57-30纳米抗体人源化案例ELISAEC50FACSEC50抗体人源化结合活性和细胞活性检测Ligandka

(1/Ms)kd

(1/s)KD

(M)SJ-2-14.835E+058.440E-041.746E-09SSJ8-H-24.043E+058.550E-042.114E-09SSJ8-H-33.900E+059.460E-042.426E-09SSJ8-H-84.368E+058.290E-041.898E-09SSJ8-H-94.255E+058.140E-041.913E-09SSJ8-H-104.206E+058.440E-042.006E-09SSJ8-H-154.483E+058.540E-041.905E-09SSJ8-H-164.641E+058.820E-041.901E-09SJ-2-1SSJ8-H-2SSJ8-H-3SSJ8-H-8SSJ8-H-9SSJ8-H-10SSJ8-H-15SSJ8-H-16抗体人源化亲和力检测纳米抗体人源化案例纳米抗体亲和力成熟······GSTSSEDAMG······AISWTHNMEPYYAD······YSSPLIEYGY······VHH“lying”ratherthan“onto”theepitopeVHHresidueswithin5AfromtheantigenarehighlightedResiduesthatareclosetotheantigenbutnotyetestablishedinteractionshavethepotentialtoincreasebindingaffinity.要求：亲和力提升5~10倍抗体亲和力成熟CDR-H126

G27

S28T29S30S31E32D33A34M35G-

PTAINDRKEQASFNHGWKQ-AE----ACDR-H250A51I52S52AW52BT53H54N55M56E57P58Y59Y60A61D---INDHYSPTAEQEQFLNHYQ----S

-CDR-H394Y95S96S97P98L99I100E100AY101G102Y---ARKESTDEAVGQ----······GSTSSEDAMG······AISWTHNMEPYYAD······YSSPLIEYGY

······组合突变建库抗体亲和力成熟亲和力检测结果IDKD(M)byBLI(HEK293)AffinityincreaseSAF51-N0631.22E-099.7foldSAF51-N0832.00E-095.9foldSAF51-N0532.11E-095.6foldSAF51-N0942.46E-094.8foldSAF51-C22.52E-094.7foldSAF51-N0932.61E-094.5foldSAF51-N0452.98E-094.0foldSAF51-N0883.29E-093.6foldSAF51-N2394.01E-092.9foldSAF51-N0234.54E-092.6foldSAF51-N2694.50E-092.6foldWT1.18E-08-抗体亲和力成熟哺乳动物细胞高通量瞬转表达抗体抗体序列引物载体构建293/CHO瞬时表达抗体纯度>90%放大生产新冠康复病人B细胞测序表达>1000抗体14株中和抗体结构解析动物实验活性验证GeniRobot“全自动分子构建平台”亲和纯化中和活性验证放大生产自主研发的无血清培养基高通量：每周>1000个抗体/项目的生产覆盖不同规模：0.1mg-千克级抗体生产高通量瞬转表达抗体构建和表达技术优化线性表达框制备96孔板培养抗体表达上清活性检测不需要质粒构建、测序、质粒提取可保持所表达抗体的功能活性2天快速完成线性框制备工作高通量的抗体表达初筛成功合成细胞无法表达的抗体片段活性与细胞表达相当3个小时完成VHH&scFv合成高通量的抗体表达初筛抗体构建和表达线性表达框制备抗体无细胞表达平台Top3minipool1-2万个cells/孔生长培养基生长培养基表达量评估0.5个cells/孔克隆培养基克隆培养基克隆培养基补料表达量评估细胞成像筛选扩增单克隆60个PDL传代稳定性测试PCB表达量评估表达量评估电转染筛选扩增MSX加压MSX加压表达量评估表达量评估CHO-K1来自英国卫生局完整的运送追踪支持文件合规完整的实验报告和原始记录生产用CHO-K1稳定株稳定株开发服务上、下游工艺开发和放大拥有完善的细胞培养工艺开发平台，通过DOE软件对工艺开发方案辅助设计。有丰富的瞬转和稳转工艺开发和放大经验。上游工艺开发/放大具备完善的蛋白质纯化工艺开发技术平台，多套国际一流的工艺设备。可提供小试工艺到中试放大工艺阶段的技术服务，满足客户在药物开发和产品申报各阶段的需求。下游工艺开发/放大Applikon8联罐反应器Applikon15L反应器全自动细胞计数仪生化分析仪STR200一次性反应器AKTApure150德国Löser冰点渗透压仪Thermo紫外检测仪上、下游放大生产原核车间真核车间5000多平米的GMP洁净车间，同时拥有原核、真核生产车间GMP级别生产抗体功能性、安全性评价04•抗体与抗原•抗体与FcγRs/FcRn/C1q•蛋白与蛋白•蛋白与小分子•亲和力排序•表位分析广泛的检测范围丰富的产品支持亲和力检测SPR案例展示BLI案例展示OCTETBiacore8KBiacoreT200JToxicolPathol.2015Jul;28(3):133–139.中和活性ADCC(ADCP)CDC内吞活性报告基因酶活因子释放增殖抑制分化凋亡趋化粘附体外药效评价Anti-CD38抗体酶活抑制检测Anti-Nectin4抗体内化Anti-OX40诱导CD4+T分泌IL2检测细胞迁移抑制试验血管生成