神经生物学研究方法

神经生物学研究方法体内实验体外实验活：培养、干预、观察、分析死：检测、分析活：培养、干预、观察、分析死：检测、分析3解剖和组织形态学研究方法4常规普通染色：确定神经核团和神经细胞类型5HRP束路追踪法：确定神经对靶组织的支配通路激光共聚焦：确定蛋白在神经中的表达方式7原位杂交：确定mRNA的表达模式9电镜：观察细微结构和亚细胞机构双光子显微镜：观察活细胞双光子荧光显微镜是结合激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。因为双光子激发需要很高的光子密度，所以为了不损伤细胞。1）脑立体定位活体注射2）活体电转染（脑泡、神经管）3）基因修饰小鼠

3.1基因突变（mutation）

3.2基因敲除（Knock-out）

3.3基因抑制（Knock-down）

3.4转基因（Over-expression）

体内实验1）脑立体定位活体注射：药物电损毁质粒DNARNA病毒载体确定对功能基因干预是否成功检测1.行为变化2.生理指标变化3.其它基因表达变化4.电活动变化RNAi-mediatedsilencingofestrogenreceptorαintheventromedialnucleusofhypothalamusabolishesfemalesexualbehaviorsPNAS2006行为学结果：Silencingofestrogenreceptorαintheventromedialnucleusofhypothalamusleadstometabolicsyndrome

PNAS20072）活体电转染（脑泡、神经管）１、鸡蛋开壳暴露鸡胚。２、图中黑线所示为神经管所在位置。３、向神经管中注入质粒DNA。鸡胚神经管电转染示意图+-4、45V电压，5次电击。5、封口，37℃培养24h，取胚进行观察。3）基因修饰动物：3.1基因突变（mutation）：自发突变和诱发突变3.2基因敲除（Knock-out）3.3基因抑制（Knock-down）3.4转基因（Over-expression）Morpholino

Inmolecularbiology,aMorpholinoisamoleculeusedtomodifygeneexpression.Morpholino

oligomers(oligos)areanantisensetechnologyusedtoblockaccessofothermoleculestospecificsequenceswithinnucleicacid.Morpholinosblocksmall(~25base)regionsofthebase-pairingsurfacesofribonucleicacid(RNA).

DevelopmentalbiologistsinjectMorpholino

oligosintoeggsorembryosofzebrafish,[9]Africanclawedfrog(Xenopus),[10]

seaurchin,[11]andkillifish(F.heteroclitus)producingmorphantembryos,orelectroporate

Morpholinosintochick[12]embryosatlaterstagesofdevelopment3.1基因突变（mutation）：自发突变和诱发突变3.2基因敲除（Knock-out）CRISP-CAS9技术张峰是爱迪塔斯医药公司的创始人之一，该公司打算利用CRISPR基因编辑技术治疗疾病。张峰:剑桥市麻省理工学院麦戈文脑研究学院神经学家4300万美元的风险投资爱迪塔斯医药公司的赞助人之一、风险投资人KevinBitterman表示：“这是一个平台，可以对各种家族遗传病产生深远影响。”CRISPR/CassystemClustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats(CRISPR)-CRISPR-associated(Cas)systemsprovideadaptiveimmunityagainstforeignnucleicacids(virusesandplasmidsDNA/RNA)inbacteriaandarchaea.ThreeclassesofCRISPRsystemsTypeI,IIandIII.TypeIICRISPRsystem,whichutilizesasingleeffectorenzyme,Cas9,tocleavedsDNA,whereasTypeIandTypeIIIsystemsrequiremultipledistincteffectorsactingasacomplex.Makarova,K.S.,D.H.Haft,etal.(2011).NatRevMicrobiol.CRISPR/Cas9Thesilencingofinvadingnucleicacidsisexecutedbyribonucleoproteincomplexespreloadedwithsmall,interferingCRISPRRNAs(crRNAs)thatactasguidesfortargetinganddegradationofforeignnucleicacid.Mali,P.,L.Yang,etal.(03January2013).Science.Hwang,W.Y.,Y.Fu,etal.(10January2013).NatureBiotechnology.Jinek,M.,A.East,etal.(29January2013).elife.CRISPR/Cas9Jinek,M.,K.Chylinski,etal.(17AUGUST2012)Science.CRISPR/Cas9proceedingLeCong,etal.(03January2013).Science.LeCong,F.A.R.,DavidCox,ShuailiangLin,RobertBarretto,NaomiHabib,PatrickD.Hsu,XuebingWu,WenyanJiang,LucianoA.Marraffini,FengZhang(2013).MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science339,819–823.主要工作：CRISPR系统在哺乳动物细胞应用载体的建立CRISPR系统crRNA的结构筛选利用CRISPR系统实现外源DNA片段重组利用CRISPR系统进行基因组片段删除CRISPR/Cas9proceedingSchematicofthetypeIICRISPR-mediatedDNAdouble-strandbreakLeCong,etal.(03January2013).Science.CRISPR/Cas9proceedingLeCong,etal.(03January2013).Science.CRISPR/Cas9proceedingSingle-andDouble-GeneTargetingInVivobyInjectionintoFertilizedEggsWang,H.,H.Yang,etal.(9May2013).Cell.显微注射Site-specificrecombinase:Cre

recombinasesystemCre-loxp

系统：用于定点基因敲除Onlyhippocampal

neuronesexpresstheCregene

举例：Sitespecificgeneknockout时间特异性转基因技术：四环素诱导系统强力霉素Turnonsystem强力霉素Turnoffsystem返回3.3基因抑制（Knock-down）获得Knock-down转基因小/大鼠：（1）常规的雄原核显微注射方法3.4转基因（Over-expression）组织特异性转基因技术:

（1）组织特异性启动子

PNAS2005鸡胚HSYNpromoter体外实验

组织培养：下丘脑、垂体、海马、活体脑切片培养等（胚胎、成年）细胞培养原代细胞基因功能细胞通路膜片钳细胞系肿瘤细胞系永生化细胞：P19一、组织培养：下丘脑、垂体、海马、活体脑切片培养等（胚胎、成年）Brainslicecultures

Bothfiguresshowssliceculturesofthecerebellum.Leftpicture:Thetypicalcytoarchitectonicorganizationofthecerebellarcortexismaintained,anditispossibletonicelydistinguishthemolecularlayer(ML)withthePurkinjecelldendrites(red),thePurkinjecelllayer(PCL)withthePurkinjecellbodies(red)andthegranulecelllayer(GCL)withthegranulecells.(green).Rightpicture:Besidesthedendritic

arbours,alsotheaxonalprojectionofthePurkinjecellsispresentintheslicecultures.细胞转染1.磷酸钙沉淀法2.电穿孔法

3.机械法

动物细胞：显微注射4.阳离子脂质体试剂

神经生物学研究新技术光遗传学

Optogenetics

用光照射整合在细胞中的光敏蛋白，可以非侵入性的改变细胞行为。光遗传学技术在神经学领域特别受欢迎，研究者们用这一技术来激活或抑制神经元的活性，实现精确的时间和空间控制。光遗传学工具既可以用于体外也可以用于体内，有助于探索神经元功能、神经元兴奋性、突触传递等问题。此外，光敏工具也可以用来二聚化蛋白或者激活转录。现有光敏蛋白的不断改进和新光敏蛋白的发现，正