核酸核酸检测技术29讲解

核酸Nucleicaciddetectiontechnology核酸检测技术DNA的生物合成（复制）基因表达：是指将遗传信息由DNA转录为RNA、再翻译成蛋白质的过程中心法则（centraldogma）遗传信息传递方向的规律复制DNARNA蛋白质转录翻译复制RNA蛋白质逆转录翻译复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNABasicRulesofDNAReplication复制的基本规律第一节一、半保留复制的实验依据和意义半保留复制的概念DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA一、半保留复制的实验依据和意义半保留复制的意义按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。二、双向复制原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。复制中的放射自显影图象三、复制的半不连续性3

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解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为前导链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链（后随链、滞后链）。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的

半不连续性。参与DNA复制的物质

dATP,dGTP,dCTP,dTTP底物(substrate)

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol聚合酶(polymerase)

dATP,解开成单链的DNA母链模板(template)

提供3’-OH末端使dNTP可以依次聚合引物(primer)其他的酶和蛋白质因子一、复制的化学反应(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi聚合反应的特点除了底物和酶外，DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5’→3’方向进行。二、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent

DNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.5'→3'

的聚合酶活性

2.核酸外切酶活性可见，DNApolⅠ是1个多功能酶功能①5′→3′聚合酶活性

与模板结合后构象改变，识别碱基，正确配对后才发挥

聚合作用②3′→5′外切酶活性

主要是对新生DNA链进行校对，防止“错配”③5′→3′外切酶活性

主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物的切除及其空隙的填补利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链解螺旋酶(helicase)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)复制起始时催化生成RNA引物的酶引物酶(primase)拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶功能理顺DNA链拓扑异构酶分类拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶ⅡDNA连接酶连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’功能DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。DNA生物合成（一）复制的起始需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。引发体和引物DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

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含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。引发体和引物引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子3

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引物3'HO5'引物酶DNA生物合成（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol领头链的合成随从链的合成（三）复制的终止原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500逆转录病毒和逆转录酶逆转录(reversetranscription)逆转录酶