《烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的测定技术报告》

《烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的测定》技术报告1前言烟草中富含茄尼醇，主要用于合成辅酶Q10、维生素K、抗癌增效剂SDB等，是当前市场上炙手可热的医药化工中间体，同时它本身也具有抗菌、消炎和止血的作用。全国每年约有50万吨这样的废次烟叶被焚烧，不仅浪费资源，而且造成土壤碱化，对生态环境造成污染，如果这些废次烟叶全部变废为宝提取茄尼醇，能产生近百亿元的经济效益，既保护了生态环境，又能充分利用烟草生产产业的废弃物，实现烟草资源的高值化利用[1-8]。从烟叶提取的茄尼醇产品中茄尼醇含量直接决定了它的市场价格，因此迫切需要规范、准确的检测方法来检测其含量。检测茄尼醇的方法很多，有库伦滴定法[9]、气相色谱法[10]、HPLC法[11-17]及液质联用法[18]。其中库伦滴定法其中重现性差；气相色谱法要经过衍生反应，样品处理麻烦；液质联用法所用仪器设备比较高端，应用不普遍；液相色谱检测结果比较理想，但方法很多，色谱条件各有不同，目前尚无统一、规范的相关检测的标准方法，因此，经国标委批准，我们制定了国家标准《烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的测定高效液相色谱法》，使检测结果更加规范和准确可靠，从而能够更加科学地评价烟叶和烟膏的市场价值。2实验部分2.1仪器与试剂2.1.1仪器：Waters2695高效液相色谱系统，Waters2996二极管阵列（PDA）检测器（或紫外检测器），Millennium32色谱工作站，粉碎机（天津太斯特仪器有限公司），超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，恒温振荡器、离心机（金坛市江南仪器厂），XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，索氏提取装置（金坛市晶玻实验仪器厂），微量可调移液器（Eppendorf），脱脂中速滤纸（ф=15cm杭州特种纸业有限公司），滤膜（0.2μm，直径25mm的聚砜膜或相当者）。2.1.2主要试剂：茄尼醇标准品（Sigma，纯度≥99.9%，美国），异丙醇（山东禹王）、甲醇（HPLC级，TEDIA，美国），水为超纯水（蒸馏水再经过Millipore超纯水系统制备），正己烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、石油醚、氢氧化钠均为分析纯。2.1.3材料：烤烟由福建省三明金叶复烤有限公司提供；白肋烟由中国烟草白肋烟试验站（湖北省烟草科研所）提供；香料烟由湖北省十堰市郧西县烟叶分公司提供；烟膏由烟草提取，自制。2.2标准溶液的配制标准储备液：精密称取茄尼醇标准样品0.05g（精确到0.0001g），用正己烷溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，制成0.50mg/mL标准溶液，4℃冰箱内保存。标准工作液：准确移取0.1、1、2、3、4、5mL茄尼醇标准储备溶液（4.7）于50mL棕色容量瓶中，用流动相溶液稀释并定容至刻度，得到一系列的标准工作溶液（质量浓度分别为1、10、20、30、40、50μg/mL），现配现用。2.3样品分析2.3.1样品的制备试样的制备将烟叶在55℃的通风干燥箱中干燥至恒重，冷却至室温，粉碎，过40目筛。制备后烟叶粉末应保存于干燥器内备用。。2.3.2样品前处理2.3.2.1烟叶：（1）茄尼醇的提取称取约2g（精确至0.0001g）烟叶粉末于50mL具塞离心管中，加正己烷20mL，旋涡振荡2min，于65℃超声波萃取15min，萃取功率为250W，4000r/min离心10min，上清液移入50mL容量瓶中。用15mL正己烷重复以上振荡、萃取和离心步骤，将沉淀物重复提取2次，合并正己烷层于50mL容量瓶中，定容至刻度。（2）游离茄尼醇测定的试样处理准确移取4mL2.3.2.1（1）提取液于10mL具塞离心管中，加入约6mL蒸馏水，涡旋振荡3min，去除水溶性杂质，4000r/min离心10min分层；准确移取1mL净化后上层正己烷提取液，用流动相稀释并定容至25mL棕色容量瓶中（如茄尼醇浓度超出标准曲线线性范围，则适当调整分取体积和定容体积），经0.2μm滤膜过滤，滤液待上机测定。（3）总茄尼醇测定的试样处理准确移取4mL2.3.2.1（1）提取液于100mL具塞棕色三角瓶中，加入4mLNaOH乙醇溶液（0.02mol/L），密封好塞子，充分混匀，在恒温振荡器中60℃～65℃水浴振荡，皂化30min；皂化后溶液在83℃～87℃水浴蒸发至近干；准确移取2mL正己烷于三角瓶中，超声2min溶解残渣，转移至另一洁净10mL具塞离心管中，重复一次以上操作溶解三角瓶中残留物转移至离心管中，再用蒸馏水约6mL多次洗涤三角瓶，合并溶液于具塞离心管中；涡旋振荡具塞离心管3min，去除水溶性杂质，离心10min分层；准确移取1mL净化后上层正己烷提取液，用流动相稀释并定容至25mL棕色容量瓶中（如茄尼醇浓度超出标准曲线线性范围，则适当调整分取体积和定容体积），经0.2μm滤膜过滤，滤液待上机测定。2.3.2.2烟叶提取物（烟膏）：称取约0.1g（精确到0.0001g）烟叶提取物，置于50mL容量瓶中，加入30mL左右正己烷溶解，置于超声波清洗器中超声5min,冷却定容至刻度。其余步骤同2.3.2.1（2）、2.3.2.1（3）测定烟膏中的游离茄尼醇和总茄尼醇。2.4色谱分析条件按照制造商操作手册运行高效液相色谱仪。以下分析条件可供参考，采用其它条件应验证其适用性：色谱柱：AtlantisT3C184.6×150mm，3μm(Waters)。流动相：异丙醇-甲醇溶液（体积比为30:70）。流速：1.0mL·min-1。柱温：35℃。紫外检测波长：213nm。进样体积：20μL。在上述色谱条件下样品中茄尼醇与杂质得到快速有效分离，分离度大于1.5，茄尼醇色谱峰保留时间在7min左右。2.5烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的定性和定量测定分别取适量的茄尼醇标准工作溶液（2.2）及待上机试样溶液，按2.4列出的条件进行液相色谱分析测定。按照保留时间进行定性，以标准工作液做单点或多点校准，并用色谱峰面积积分值定量。待测样液中茄尼醇的相应值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析，并在试样溶液分析间适当穿插标准工作液，以确保定量的准确性。定量分析：烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的含量由式（1）计算得出：试样中茄尼醇的含量按式（1）进行计算：………………(1)式中：X试样茄尼醇的含量（以质量分数计，若测定鲜基含量则要测定鲜样制成试样损失的水分，再将试样中茄尼醇的含量换算成鲜基中茄尼醇含量。），单位为克每百克（g/100g）；cs标准溶液中茄尼醇的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；A试样溶液中茄尼醇的峰面积数值；V试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；f试样稀释倍数；As标准溶液中茄尼醇的峰面积数值；m试样质量，单位为克（g）。测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字。在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。3结果与讨论3.1液相色谱分析方法的优化3.1.1检测波长的确定：利用二极管阵列检测器采集样品的3D图并截取茄尼醇标准品的紫外光谱图（图1）。从光谱图可以看出：茄尼醇在210nm波长处有最大吸收，考虑到仪器的稳定性，选择213nm为检测波长。aλ/nmaλ/nmA/AUA/AUbbt/minλ/nm图1(a)样品3D图谱和(b)茄尼醇紫外光谱图Fig.1(a)3Dgraphsofsampleand(b)UVspectraofsolanesol3.1.2流动相的确定：色谱柱选择AtlantisT3C18柱（4.6×150mm，3μm），考察甲醇、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈、异丙醇-乙腈等流动相，发现前四种流动相茄尼醇色谱峰尽管也能和杂质很好分离，但色谱峰保留时间太长，流动相为V（异丙醇）∶V（甲醇）=30∶70时，茄尼醇与杂质能得到快速有效分离，分离度大于1.5，茄尼醇色谱峰保留时间在7.5min（图2）。进空白样品保留时间为7.5min时没有出现色谱峰，说明流动相溶剂在210nm处不会对测定产生干扰。A/AUa茄尼醇(solanesol)a茄尼醇(solanesol)A/AUb茄尼醇(solanesol)b茄尼醇(solanesol)t/min图2(a)对照品和(b)样品的高效液相色谱图Fig.2HPLCchromatogramsandUVspectraof(a)referencesubstancesand(b)asample3.2样品前处理条件的优化3.2.1提取条件的优化：本实验考察了索氏提取法和超声波提取法萃取烟叶中的茄尼醇。（1）索氏提取法称取约2g(精确到0.001g)烟叶粉末于滤纸中，包好（样品不可装得太紧，以免影响浸抽效果），滤纸包长度应以可全部浸泡于提取溶剂中为准。将滤纸包放入索氏提取器的抽提管内，下接抽提瓶（规格为100mL），在抽提瓶中注入3/4容积的提取溶剂，在水浴(用蒸馏水)上加热，使提取液回流，控制提取溶剂回流次数为每小时约7次，回流完，取出试样，仍用原提取器回收提取溶剂直至抽提瓶内液体少于30mL，取下抽提瓶，擦净瓶外壁，将提取液转移至50mL容量瓶，用提取溶剂分多次将抽提瓶里的物质转移至容量瓶，定容至刻度。本实验考察了五种提取溶剂（正己烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、石油醚），不同提取时间（2、4、6、8、10、12、14）对烟叶粉末中游离态茄尼醇测定结果的影响，结果见图3。图3索氏提取法提取溶剂和提取时间对游离茄尼醇测定值的影响Fig.3Theeffectofsolanesolmeasuredvaluewithdifferentabstractingsolventsandtimebysoxhletextractionmethod从图3可以看出，乙醇、甲醇、丙酮对茄尼醇的提取率低。正己烷、石油醚提取率高，而用正己烷提取8h才能提取完全，且正己烷沸点为80.7℃，需将水浴温度调高到99℃才能达到理想的回流速度，此时水浴锅里的蒸馏水易挥发，需要不断补充蒸馏水，实验过程繁琐。用石油醚提取6h即能提取完全，石油醚沸点为30～60℃，水浴温度控制在80～85℃即能达到理想的回流速度，水浴锅加满水后，蒸馏水挥发很慢,完成一个提取过程不需补充蒸馏水。因此，选用石油醚作为索氏提取法的提取溶剂。（2）超声波提取法按照2.3.2.1步骤，用正己烷超声萃取得到的茄尼醇测定值为1.95g/100g。用石油醚代替正己烷，将超声萃取温度改为35℃（石油醚沸点为30～60℃，高于35℃萃取时溶剂挥发），其它条件不变，得到的游离态茄尼醇测定值为1.91g/100g，用甲醇代替正己烷，将超声萃取温度改为55℃（甲醇沸点为64.5℃，高于55℃萃取时溶剂易挥发），其它条件不变，得到的游离态茄尼醇测定值为1.65g/100g；甲醇提取率相对较低，其它两种溶剂都能达到较高的提取率，考虑到正己烷成分比石油醚单纯，对液相色谱测定的干扰少，且正己烷沸点为80.7℃，较石油醚不易挥发，故选用正己烷作为提取剂。（3）比较两种提取方法索氏提取法石油醚提取需6h，而超声波提取法只需45min，既省试剂又省时间，而且操作简单易行，故选择超声波提取法萃取烟叶中的茄尼醇。3.2.2皂化条件的优化（1）皂化碱的稀释剂及其它皂化条件对皂化率的影响皂化反应是界面反应，任何影响油水二相分散程度以及界面上二相分子接触的因素，都会影响皂化反应速度和皂化程度，稀释剂是使二相分子接触的环境，故皂化反应的进行需要使用稀释剂。本方法考察了稀释剂及其它皂化条件对皂化率的影响，水、甲醇、乙醇是常用的稀释剂，由于它们沸点不同，故分别对其进行正交试验。碱用量、碱浓度、皂化温度、皂化时间对皂化率均有显著影响，故移取茄尼醇提取液9份，分别以上述3种稀释剂溶解NaOH，对以上4因素各因素3水平设计L9(34)正交皂化试验。以乙醇作稀释剂的因素水平设计见表1，正交试验结果见表2；表1因素与水平表Table1Factorsandlevels水平因素碱用量/mL碱浓度/(mol/L)皂化温度/℃皂化时间/min1A1=2B1=0.005C1=45D1=302A2=3B2=0.01C2=55D2=403A3=4B3=0.02C3=65D3=50表2正交实验设计L9(34)及结果Table2OrthogonaldesignL9(34)andresults试验号ABCD总茄尼醇测定值/(g/100g)碱用量碱浓度皂化温度皂化时间111111.76212221.89313332.11421231.99522312.34623122.02731321.99832132.00933212.54Ⅰ5.765.745.786.64Ⅱ6.356.236.425.90Ⅲ6.536.676.446.10K11.921.911.932.21T=Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ=K22.122.082.141.9718.6K32.182.222.152.03R0.770.930.660.20浓度改为0.1mol·L-1[19]，总茄尼醇测定值为2.51%，与碱浓度为0.02mol·L-1的皂化条件的测定结果差别不大，说明皂化条件A3B3C2D1已能够使茄尼醇酯充分皂化。从表2可以看出，皂化温度55℃～65℃能皂化充分，且C2、C3测定结果基本一致，故选择该组合为最佳皂化条件，即4mL0.02mol·L-1NaOH的乙醇溶液，60℃～65℃皂化30min。该条件经重复实验（n=6），总茄尼醇测定值RSD＜5.0%。甲醇和水作为稀释剂的正交实验结果总茄尼醇测定值均低于乙醇作稀释剂的最佳皂化条件的测定结果。且甲醇沸点为64.5℃，乙醇沸点为78.3℃，皂化过程甲醇较乙醇易挥发，同时甲醇毒性较乙醇大，故排除用甲醇作皂化反应稀释剂。而水作稀释剂其与正己烷不能互溶，皂化过程需要不停振荡，操作繁琐。故我们选择乙醇作为稀释剂溶解NaOH，进行皂化反应。（2）碱的种类对皂化率的影响常用的皂化用碱有NaOH和KOH，通常KOH比NaOH的催化作用大，而NaOH比KOH便宜。将皂化条件：“4mL0.02mol·L-1NaOH的乙醇溶液，60℃～65℃皂化30min”中NaOH改成KOH按照2.3.2.1(3)进行测定，总茄尼醇测定值为2.57g/100g，说明两种碱对皂化率的影响差别不大，故选用较便宜的NaOH作为皂化用碱。3.3线性范围与线性方程取茄尼醇系列标准溶液（2.2）各进样20μL进行测定，以峰面积Y对茄尼醇质量浓度X（μg•mL-1）进行线性回归分析，线性回归方程为Y=4.16×104X-2.96×103，相关系数r=0.9999。结果表明：在1～50.0μg•mL-1(0.1～5.0g•100g-1)范围内线性关系良好。3.4定量限、检出限及定量计算以信噪比（S/N）约为10计定量限（LOQ），以S/N约为3计检出限（LOD），采用空白溶液添加标准溶液的方法，得到定量限为0.003μg•mL-1（0.0003g•100g-1即3mg•kg-1），检出限为0.001μg•mL-1（0.0001g•100g-1即1mg•kg-1）。同时采用外标法定量计算样品中茄尼醇的含量，其计算公式如下：式中：C为样品中茄尼醇含量，单位为g•100g-1；X为校正曲线中查得的茄尼醇含量，单位为μg•mL-1；A为样品稀释倍数；V为样品提取液体积，单位为mL；m为取样量，单位为g。3.5方法的回收率称取约1～2g（精确到0.001g）烟叶粉末于50mL具塞离心管中，添加一定浓度水平的茄尼醇标准溶液，采用2.3.2的实验方法，提取、净化、稀释、过滤后上机检测，测定游离态茄尼醇回收率和精密度。同样称取约1～2g（精确到0.0001g）烟叶粉末，添加一定水平的茄尼醇标准溶液，提取、皂化、净化、稀释、过滤后上机检测，测定总茄尼醇回收率和精密度。每个水平作6次平行实验，其不同添加水平的回收率及精密度见表3，回收率良好。表3茄尼醇加标回收率Table3Recoveryofsolanesol检测参数样品名称取样量（g)茄尼醇含量(g/100g)样品中茄尼醇含量(mg)加入茄尼醇量(mg)实测茄尼醇量(mg)回收率（%）平均回收率（%）游离茄尼醇烟叶11.19361.7921.41031.399.598.3烟叶32.18131.3228.82048.296.8烟叶62.11920.89118.94058.498.8烟膏10.149618.527.71037.699.0烟膏20.121115.318.52038.097.4总茄尼醇烟叶11.19862.3828.51038.195.597.0烟叶32.23132.5657.12076.697.4烟叶61.01921.3013.24052.096.9烟膏10.125325.131.51041.398.1烟膏20.111922.224.82044.397.23.6方法的精密度3.6.1进样重复性各取一份烟叶、烟膏待测液，按本方法2.4、2.5步骤各重复测定6次，结果见表4，可以看出，RSD均小于1%，说明本方法进样重现性良好。表4茄尼醇进样精密度(n=6)Table4Precisionofinjectingofsolanesol(n=6)样品名称编号茄尼醇含量平均值标准偏差RSD（g/100g)（g/100g)（g/100g)（%）烟叶10.8480.8490.0050.5920.84430.85640.84350.84960.851烟膏115.115.00.0320.21215.0315.0415.0515.0615.03.6.2实验方法本身的重复性各取一份烟叶、烟膏样品，每个样品称取6份，按照1.4对样品进行处理后上机测定，结果见表5。可以看出，RSD均小于5%，说明本方法具有良好的精密度。表5茄尼醇检测方法精密度(n=6)Table5Precisionofthedetectionmethodofsolanesol（n=6)样品名称编号游离茄尼醇总茄尼醇含量平均值标准偏差RSD含量平均值标准偏差RSD（g/100g)（g/100g)（g/100g)（%）（g/100g)（g/100g)（g/100g)（%）烟叶10.7220.750.0273.51.591.540.0754.920.7241.5230.7761.5640.7821.3950.7711.5860.7461.57烟膏115.315.40.1651.122.722.50.4422.0215.223.1315.322.4415.522.1515.722.7615.521.93.6.3日间精密度各取一份烟叶、烟膏样品，每隔2天将样品测定一次，连续测定6次，按照2.3对样品进行处理后上机测定，计算样品含量，测得烟叶游离茄尼醇RSD为3.7%、烟叶总茄尼醇RSD为4.7%、烟膏游离茄尼醇RSD为1.6%，烟膏总茄尼醇RSD为2.2%，RSD均小于5，说明本方法日间重现性良好。3.7共同实验结果本项目开展了对比试验，选择了烤烟、白肋烟、香料烟3种类型的卷烟进行分析。比对的6家实验室分别为：福建省农科院中心实验室、中国烟草总公司郑州烟草研究院、中国农科院烟草研究所、福建省农产品质量安全检验检测中心、福建省产品质量检验研究院、福建省分析测试中心，实验结果如表6所示。表6茄尼醇共同实验结果（g·100g-1）序号样品名称检测参数ABCDEF均值RSD(%)1烤烟游离茄尼醇0.5280.5400.5800.5850.5590.4810.5457.0总茄尼醇0.7600.7970.8140.8160.8110.7870.7982.72白肋烟游离茄尼醇1.001.011.031.020.9810.9801.002.2总茄尼醇1.021.051.041.091.021.251.088.13香料烟游离茄尼醇0.2220.2140.2130.2120.2150.1870.2115.7总茄尼醇0.2440.2490.2500.2420.2600.2640.2523.44烟膏游离茄尼醇14.714.614.514.714.714.214.61.4总茄尼醇19.818.620.219.118.420.619.44.6其中：A：福建省农科院中心实验室，B：福建省农产品质量安全检验检测中心，C：福建省产品质量检验研究院，D：福建省分析测试中心，E：中国农科院烟草研究所，F：中国烟草总公司郑州烟草研究院。由表6所示的结果可见，6家实验室实验结果的RSD均小于10%，说明各家实验室结果较为接近，本方法再现性好。3.8实际样品的测定结果本实验设定的条件下，我们测定了福建省三明金叶复烤有限公司、中国烟草白肋烟试验站（湖北省烟草科研所）、湖北省十堰市郧西县烟叶分公司提供的3种烟叶样品（烤烟、白肋烟、香料烟）、烟梗样品及自制烟膏样品，茄尼醇标样峰与样品中的杂质峰均达到良好的分离，测定结果见表7。表7不同样品中茄尼醇含量g·100g-1Table6Solanesolcontentsindifferentsamples样品名称游离茄尼醇含量总茄尼醇含量烟叶1（烤烟）1.792.38烟叶2（烤烟）0.5300.737烟叶3（白肋烟）1.942.56烟叶4（白肋烟）0.9721.05烟叶5（香料烟）0.2110.245烟叶6（香料烟）0.8911.30烟梗0.00030.0005烟膏118.525.1烟膏214.322.2参考文献：[1]NarosionhaRaoCV,ChakrabortyMK.Solanesolfromtobaccowaste[J].ResearchandIndustry,1979,24(2):83-85.[2]王非，郑珩，余永柱，杨欣.高纯度茄尼醇的现状与市场前景[J].现代化工，2005，25（8）：63-66.[3]陈爱国，申国明，梁晓芳，等.茄尼醇的研究进展与展望[J].中国烟草科学，2007，28（6）：44-48.[4]李军，李吉昌，吴晓华，等.烟草废弃物利用研究[J].云南化工，2010，37（2）：44-49.[5]黎新江，张彬，周武.高纯度茄尼醇的分离及测定[J].安徽农业科学，2008，36（26）：11389-11390.[6]张晓仿，曹栋，邓国栋.从废次烟草浸膏中提取茄尼醇的皂化试验[J].烟草科技，2007（5）：50-52.[7]顾正桂，刘玲，顾美娟，林军.采用分离集成技术提取废弃烟叶中精品茄尼醇[J].化学工程，2010，38（10）：136-140.[8]许玉君，黎四芳，刘苗，等.超声波辅助两相提取茄尼醇的研究[J].厦门大学学报（自然科学版），2010，49（5）：649-653.[9]刘快之，李德亮，陈伯森，等.库仑滴定法测定烟叶提取物中茄尼醇[J].化学研究，1997，8（3）：56-59.[10]Sev