遗传标记检测方法及连锁分析

遗传标记检测方法及遗传分析单

基因遗

传病及

致病基

因的克

隆7有雀斑

vs

无雀斑直发

vs

卷发左

撇子香港时尚模特女孩

Chiu(

白化病

)史蒂芬

·

威廉

·

霍金肌萎缩性侧索硬化症英国维多利亚女王及其家族

血友病侏儒症鱼鳞病掌跖

角

化Waardenburg短指症

神经纤维瘤病人

类的多指

畸形症•单基因疾病

（如镰状红细胞贫

血）主

要发

生在

新

生儿和幼儿阶段•

多基因疾病

（如精神分裂症）主要

发生在

成人

时期遗

传

病

是

多

种

疾

病

和

死

亡

的

重要

原

因单基因疾病

是指那些由于单个基因的突变而引起的遗传病由于单基因病发生基本上受一对等位基因的控制，其遗传方式符合孟德尔定律，因此又称为

孟德尔遗传病显性遗传隐形遗传Online

Mendelian

inheritance

in

Man1.

常染色体遗传2.

性染色体遗传单基因疾病

(

孟德尔遗传病）遗传方式

：

常

染色体显

性遗传常

染色体隐

性遗传

x

连

锁

显

性

X-

连锁遗传

X

连

锁

隐

性

Y

染色

体遗

传常染色体显性遗传：1.

致病基因在杂合状态下即可致病2.

患者的双亲中，有一个患者，患者的同胞中，有

1/2

的可能性为患者3.

无病患个体的后代不会患此病4.

在系谱中，疾病连续相传，无间断现象常染色体隐形遗传：1.

致病基因只有在纯合状态下才致病2.

患者的双亲表型正常，但均为携带者，患者的同胞对中有

1/4

的可能性为患者3.

在系谱中，患者的分布是散在的，通常看不到连续传递的现象X-

连锁显性遗传1.

女性患者的子女有

1/2

可能发病，男性患

者的所有女性后代均发病，男性患者的男

性后代均不发病2.

在系谱中，疾病连续传递，无间断现象X-

连锁隐性遗传1.

往往只见到男性患者2.

女性患者的父亲亦为患者，母亲为携带者One

way

to

think

about

genesEach

puzzle

piece

would

represent

a

set

of

genes

organized

in

a

specific

way,

similar

to

a

chromosome.Finding

a

Gene

on

the

Chromosome

MapMother

’s

geneFather

’s

gene

Child’s

geneThe

information

carried

in

genes

differs

slightly

from

person

to

person.This

is

what

makes

each

of

us

unique.

As

a

result,

the

colors

of

thepuzzle

pieces

would

be

different

between

family

members.

The

childreceives

exactly

half

of

its

genetic

information

from

the

mother

andexactly

half

from

the

father.Genetic

disorder

runs

in

familiesFind

the

puzzle

piece

that

is

responsible

for

Disorder123456789101112Gene

cause

diseaseCollins

FS.

(1992)

Nature

genetics

1:3-6苯丙酮尿症（

PKU

）：使得苯丙氨酸及苯丙酮酸积蓄并从尿中大

量排出，临床伴有智力低下，色素减少等。发病率

1/16500定位克隆：

通过

RFLP

、

STR

、

SNP

等遗传标记

，获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法克隆基因。先定位、后克隆、

不依赖于现有研究基础基因定位方法家系连锁分析法

随着人类基因组图谱已经绘制完成

，物

理定位

法已被

查找

基因组图谱所取代。但对许多尚未

被克隆

的致

病基因

而言，

因基因序列未知，其在染色体上无

从查找

，家

系分析

成为最

基本的定位方法

。全外显子测序法随着全基因组测序技术的深入发展

，全

外显子

测序方

法寻

找致病基

因扮演着越来越重要的角色。家系连锁分析法基本理论准备独立遗传

independent

assortment完全连锁

complete

linkage交换重组重组型配子重组型配子亲本型配子亲本型配子32

基因在每条染色体内是直线排列的

,

染色体可以自由组合，

而排在一条染色体上的基因是不能自由组合的。这种特点称为基因的

“

连锁

”两个基因间的重组率与它们的距离有关，

相距越近重组率越小

，重组率为

1%

时的遗传距离为

1cM

，约相当于

100

万

bp

。两个基因间的重组率也是相对恒定的，重组率的大小反映基因座在染色体上相对距离。重组值可以通过新组合在整个后代中的比例来推算。重组率介于

0-50%

之间，但在遗传图上可以看到超过

50cM

的现象，这是

因

为

两

个

基

因

间

发

生

了

多

次交

换

。33Ⅰ

-2Ⅱ

-2Ⅲ

-2Ⅳ

-2Ⅱ

-5

Ⅲ

-8

Ⅳ

-6连锁分析：是基于家系研究的一种方法，

是单基因遗传病定位克隆方法的核心。

他是利用遗传标记在家系中进行分型，

再利用数学手段计算

遗传标记

在家系中

是否与疾病发生共分离遗传标记Chrom.

1Chrom.

2Chrom.

3……

遗

传

标记第一代遗传标记

:

限制性片段长度多态性

(Restriction

Fragment

Length

Polymorphism,

RFLP)

。第二代遗传标记

:

微卫星

(Microsatellite)

，其重复单

位长度一般为

2

－

6

个核苷酸。分布广﹑数目多﹑具有

高度多态性。第三代遗传标记

：单核苷酸多态性标记

(

SNP

),

数量庞大，

分布广泛。36微卫星标记

420M9-3663

（上）和

478B14-848

（下）的基因分型图

Lod

值（对数优势比）：

两个基因座按一定的重组率而相互连锁的可能性与两个基因座互不

连锁的可能性之比，这个可能性之比的

10

作底的对数就是对数优势比LOD=log

10

(likelihood

of

data

If

loci

linked

at

θ

/

likelihood

ofdata

if

loci

unlinked

at

θ

=0.5

）0≤

θ

≤

0.5LOD

score

=

Z

=

log

10[1

12θ

4

(1-

θ

)+

2

θ

(1-

θ

)

4

]

-

5

log

10

(0.5)LOD

值≥＋

3

被认为是两个基因座肯定连锁的证据。因为

LOD

值是以

10

为底区对数计算的，

LOD

值＋

3

表明大于或等于

1000

：

1

可能性，也就是说，所观察到的连锁不是偶然发

生的。LOD

值为－

2

则表示

100

：

1

的连锁机会，被认为是排除连锁

的证据。41连锁分析常用软件

•Linkage

package

•Genehunter

•Cyrillic

•Fastmap—————————————————————————————————LOD

SCORE

AT

θ

=————————————————————————————————Marker

0.0

0.01

0.05

0.1

0.2

0.3

0.4———————————————————————————————————————

D2s2177

-1.94

3.13

3.67

3.66

3.13

2.26

1.16

D2s335

-2.18

2.89

3.45

3.46

2.97

2.15

1.10

D2s2302

-3.24

1.91

2.67

2.83

2.51

1.79

0.80

D2s2188

6.18

6.09

5.70

5.19

4.08

2.83

1.41

D2s2314

6.78

6.68

6.25

5.70

4.49

3.12

1.57

D2s2310

6.78

6.68

6.26

5.70

4.49

3.13

1.57

D2s2273

6.20

6.11

5.72

5.21

4.10

2.85

1.42

D2s364

2.09

2.06

1.91

1.73

1.32

0.86

0.34

D2s161

0.29

0.28

0.27

0.25

0.20

0.14

0.08

D2s315

-2.79

-0.68

0.69

1.14

1.27

1.0

0.52

D2s117

-12.53

-2.94

-0.77

0.22

0.90

0.90

0.55—————————————————————————————————举例“The

present

case

demonstrates

that

the

law

operates

in

man

as

in

plants

andlower

animals.

The

abnormality

is

shown

here

to

be

a

dominant

character”HistoryFamily

and

BDA1

photosin

Farabee’s

dissertation无

大

家

系怎

么

办？全

外

显

子

组测

序举例连锁分析：需大家系；定位后隐藏有数个基因全外显子组测序：生物信息学分析；致病位点遗传异质性（

Locus

heterogeneity

）

家系的连锁分析

+特定区域全外显子组测序遗传疾病的致病基因突变克隆孟德尔遗传病致病基因的意义为揭示基因功能、调控方式提供

最直接

的证

据为早诊断、产前诊断提供标志物为相关药物开发提供药物靶标多

基因遗

传病及

致病基

因的寻

找高血压糖尿病精神分裂症肥胖老年黄斑变性风湿性关节炎等/GWAStudies/多基因疾病：由

多个基因与环境因子

共同作用所引起的遗传性疾病。它包括由一个主基因和其他基因加上环境因子共同作用所引起，以及由相当多的微效基因共同参与加上环境因子所引起。其遗传方式复杂，很难在一个家族中确定正常个体和患病个体。只有通过对大量病人进行研究后，方能确定遗传因子在多基因病发生中的作用。多基因遗传要点：⒈数量性状的遗传基础是两对以上基因⒉这些基因之间没有显，隐性的区别，而是共显性⒊每个基因对表型的影响很小，称为微效基因⒋微效基因具有累加效应，即一个基因对表型作用很小，但若干个基因共同作用，可对表型产生明显影响⒌每对基因的行为都遵循三大定律⒍不仅遗传因素起作用，环境因素也具有明显作用

。基因环境少数单基因疾病大多数疾病是多基因疾病－－多种基因和环境共同作用的疾病－－－复杂的机制Qualitative

traits

and

quantitative

traitsClassical

medelian

traits

2

or

more

allele

of

a

gene

With

little

or

no

environment

effect

Linkage

studynon-medelian

traits

Many

genes

modified

by

environment

effectAssociation

study质量性状数量性状Complex

disease

and

quantitative

traitsCommon

disorders

are

quantitative

traits

！Obesity-----

？Hypertension-----

？Depression------

？Schizophrenia,

autism,

arthritis,

et

al（

Endophenotype

or

intermediate

phenotype

）Complex

disease:Mutiple

genes

with

subtle

effectsEnviroment

factorsQuantitative

traitsAssociation

study

:Method

for

identifying

genes

in

complex

disease:

Case-control

design

Family-based

designQuantitative

trait

associationHeritabilitySingle

Nucleotide

Polymorphism

（

SNP

）（

allele

、

genotype

）Linkage

DisequlibriumHaplotypeTag-SNPHardy-Weinberg

Equilibrium

多基因疾病的遗传率（度）

（

heritability

）•

在多基因遗传病中，易患性的高低受遗传基础和环境

因素的双重影响，其中遗传因素所起作用的大小程度

称为遗传度或遗传率。高血压MZ

同病一致率：

0.6

DZ

同病一致率：

0.3

遗传度：

0.6•

在多基因病中，遗传率可高达

70%-80%

；遗传率为

30%

～

40%

或更低，表明环境因素在决定发病上更为重

要，遗传因素的作用不显著。表

6-7

人类一些性状的遗传力性状

遗传力

性状身材

0.81

理科天赋坐高

0.76

数学天赋体重

0.78

文史天赋口才

0.68

拼写能力IQ(Binet)

0.68

先天性幽门狭窄IQ(Otis)

0.80

精神分裂症唇裂

0.76

糖尿病高血压

0.62

冠状动脉病遗传力0.340.120.450.530.750.800.750.65Single

Nucleotide

Polymorphism•

人类基因序列的变异大多是单核苷酸的变异。不同人群中

SNP

的频率分布有差异，而这些差异可以代表某一人群的遗

传差异。因此，探测

SNP

的工作可以看作是对人类“遗传路

标”（

genetic

signposts

）的勘定。•

大多数

SNPs

是单纯多态性

pure

polymorphic

，但也有一些与疾病的发生有关联

causative

mutations•

一般而言，

SNP

是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于

1

％•

在人类基因组中大概每

1000

个碱基就有一个

SNP

，人类基因

组上的

SNP

总量大概是

3

×

10

6

个。

The

mostcommon

sources

of

genetic

variation

between

humanSNPTG

G

GTG

TG

T

GTGCoding

SNPTG

GTG

T

ThrThrMis-sense

SNPGT

GHis

GT

T

GlnIntronic

SNP

–

iSNP

–

does

not

cause

an

amino

acid

changeRegulatory

region

SNP

–

effect

amount

of

protein

expressed

or

if

expressed.Coding

region

：

Also

cover

synonymous

（同义的）

and

non-synonymousSNP

的类型•

SNP

是继人类基因组计划之后又一国际研究竞争新热点，是阐明基因组功能及特点的重要基础

。•

SNP

是人类基因组

DNA

序列变异的主要形式，是决定人类疾病的重要遗传基础

。•

以前是争夺基因Linkage

Disequilibrium

:A

1

A2

allele

at

locus

1:

P

A1;

P

A2B1

B2

allele

at

locus

2:

P

B1;

P

B2If

two

loci

are

independent,

then

P

A1B1

=

PA1*PB1;

P

A1B2

=

PA1*PB2………..If

two

loci

are

dependent,

P

A1B1

is

higher

or

lowerthan

PA1*PB1.Thus,

the

two

loci

are

said

to

be

in

LD

(0<D’<1)Haplotype:A

haplotype

is

a

combination

of

alleles

atdifferent

loci

that

are

transmitted

togetherTag-SNPs

：Tag-SNP

is

a

representative

SNP

in

a

region

ofthe

genome

with

high

LDAssociation

study

:Method

for

identifying

genes

in

complex

disease:

Case-control

design

Family-based

designQuantitative

trait

associationCase-Control

StudyRFLPmicrosateliteSNPsStudy

design

is

very

important

!!1.

Population

substructure

and

selection

bias2.

Sample

selection

(phenotype

definition)3.

Sample

Size4.

Genetic

architecture5.

Appropriate

statistical

analysis6.

Replication

of

positive

results

in

anindependent

cohortPaper

1(Conventional

case

control

study)Paper

2(Extreme

selection)Family-based

designA/CC/CN=50AC:CC=50:50AC:CC=70:30A/C

or

C/C•

病例与对照研究

属于

回顾性研究

，是观察性研究中常用的一种设计方案，是在患有某病的病例组和不患有该病的对照组，或者是在具有某项特征的病例和不具有某项特征的病例中进行，调查过去或最近有无暴露于某因素的历史，而该因素被疑为和该病的发生有联系，或者调查是否存在某因素，而该因素疑为和疾病的某项特征有联系。然后比较两组的暴露情况或具有某因素的情况，验证某因素和疾病是否确实存在联系，联系的性质和程度。

病例与对照研究可用于对疾病致病因素或危险因素的调查，药物有害作用的研究，探讨影响疾病预后的因素等研究。•

队列对照研究

可采用

前瞻性方式

，以开始观察的时间为始

点，将被观察的人群按其是否接触可能的致病因素或措施，

分为两个群体，随访一定时期后，确定并比较各群体中，

新发生病例数或某种效应的差异。•

队列对照研究是群体研究中常用的方案，被观察的人群是否接触某种致病因素，是自然分配而形成的两个群体，研究者既不能随机安排，也不可能加以控制。研究对象要有足够的观察时间，在自然病程中要有充分的时间，使危险因素的作用能够表现出来。全部被观察者都必须进行随访，队列中失访人数增加，将会影响所观察的结果。

凡在群体中研究可能的致病因素或某项处理措施对固定人群的影响，均可使用队列研究，常用于病因研究，治疗性研究，预防性研究或预后研究。人类复杂疾病研究策略1.

样本选择2.

基因选择3.

SNP

选择4.

分型方法选择样本选择：1.

Case-Control2.

Family-based3.

Population-based4.

Twin

StudyCase-Control

StudyTwin

StudyTwin

study:1.

Heritability

and

environmental

factor2.

The

additional

MZ

individual

can

elevate

the

statistical

power

for

association

by

up

to

~40%UCSD

Twin

project

(began

in

2001)5

years

follow

up

Heritability

(h

2

)

of

environmental

stress

BP

response

in

twins:The

“cold

pressor

test”

(“CPT”:

one

hand,

0ºC

ice

water,

60

sec)

Ice

bucketusing

Colin

Pilot

hardware

and

ATLAS/ANS/TDA

software

.2.

基因选择胰岛素信号通路激素合成代谢通路3.

SNP

选择How

to

choose

SNPs?1.

Tag-SNPs

（

Haploview

）2.

Functional

SNPs

（

NCBI

SNP

）4.

分型方法选择分型方法1.

直接测序2.

Taqman

探针3.

Massarray

分子量阵列技术4.

GWAS

：全基因组关联分析Taqman

探针•

按照分子量来区分不同的核苷酸dAMP

=

313.2

DadCMP

=

288.2

DadGMP

=

329.2

DadTMP

=

304.2

Da•

无需标记，无需电泳•

成本低，灵敏度高，精确定量Massarray

分子量阵列技术MassARRAY

™

分子量阵列技术平台•

有

FDA

论证，可进行产前诊断的同类仪器仅有

MassARRAY

™分子量阵列技术平台；•

美国西格诺公司（

SEQUENOM

Inc

）

生产；•

基于飞行时间质谱（

MALDI-TOF

MS

）技术•

按照分子量来区分不同的核苷酸dAMP

=

313.2

DadCMP

=

288.2

DadGMP

=

329.2

DadTMP

=

304.2

Da•

无需标记，无需电泳•

成本低，灵敏度高，精确定量Massarray

分子量阵列技术平台制造厂商：

Sequenom

Inc安装日期：

2008实验室：明道楼

307联系电话：

：

Sequenom

IncSetting

date

：

2008Room

：

307,

Mingdao

BuildingContact

：

parameter

：

High

resolution,

High

accuracy,High

sensitivityApplication

：Genotyping,

epigenetics,

gene

expressionMassARRAY

iPLEX

分型技术•

基于多重

PCR和单碱基延伸技术36

重反应时，每个

SNP

分型成本远低于测序成本••••••

MassARRAY

iPLEX

分型技术PCR

重数

：

1~40

重（平均

33.5

）；每个反应所需基因组

DNA

：

<10ng设计成功率：

>95%

；分型准确率：

>99.7%

；每天处理样品数：

>3000

个；可进行

定量分析

*分子量阵列技术平台主要技术指标•

检测范围：可对

6-40bp

核酸片段进行分子量测定和定量分析。•

激光器

:

氮激光器

20

Hz•

离子源

:

Smart

光栅•

飞行距离

:

800

毫米•

真空压

:

5

x

10

-6

mbar•

检测器

:

电子倍增管•

高电压关启：数据读取完成后，自动关闭高电压。•

软件：自动分析数据，直接提供生物学结果。Genome-Wide

Association

Study

(GWAS)基于芯片的

SNP

检测•

通过酶反应的间接杂交•