《三维设计 新课标高考总复习 生物》课件 第2讲 重点研究“基因工程操作中限制酶的选择和PCR技术”

基因工程操作中目的基因的获取和基因表达载体的构建都离不开限制性内切核酸酶，只有选取合适的限制酶才能准确切取目的基因，因此限制酶的选取是基因工程操作的重点也是难点，近年来较难的高考试题大都围绕限制酶的选取进行考查。PCR技术既可以用于获取目的基因，又可以用于目的基因的检测与鉴定，是基因工程中重要技术之一，其应用较强，因此对PCR技术的考查也成为命题的热点。深化提素养1．(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、

DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(

)A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接解析：只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，且E.coliDNA连接酶无法连接酶3切出的平末端，A不符合题意；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，两者切割后无法相互连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C符合题意；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不符合题意。答案：C

2．(2022·山东高考)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG­P和FLAG­P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是______________________________________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是__________________________________。(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG­P、FLAG­P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG­P和FLAG­P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是____________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是__________________________________________________。

(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是_______________________________________________________________。解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此设计扩增P基因的引物需要满足的条件是能与P基因母链的一段碱基序列互补配对，并且是短单链核酸。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸添加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可以看出，P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。解决该问题的修改方案是在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加一个碱基，使EcoRⅠ识别序列不影响P基因的正常翻译。(3)①组仅添加UBC；②组添加UBC和FLAG­P；③组添加UBC、FLAG­P和药物A；④组添加UBC和FLAG­P△；⑤组添加UBC、FLAG­P△和药物A。按题中所述处理后，①组没出现杂交带，②③组出现杂交带，③组杂交带更加明显，说明药物A的作用是增强FLAG­P与UBC的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组含有FLAG­P，出现杂交带，④⑤组含有FLAG­P△，没出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列的作用是参与P与UBC的结合。(4)根据(3)的分析推测，药物A通过增强P与UBC结合促进P降解，达到治疗该病的目的。答案：(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸5′端(2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加一个碱基(3)增强FLAG­P与UBC的结合参与P与UBC的结合(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解

知能集成(一)探讨基因工程操作中限制酶的选择方法1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。(2)不能选择切点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。2．根据质粒的特点确定限制酶的种类3．根据Ti质粒的T­DNA片段选择限制酶图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：[典例]

玉米是重要的粮食作物，其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白，由P基因编码，在植物生长发育过程中对水分的吸收具有重要的调节功能。科研人员成功培育出超量表达P蛋白转基因玉米，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图所示。请回答下列问题：(1)强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被________________识别并结合，驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用____________________酶组合，将Ti质粒切开后构建重组表达载体。T­DNA在该实验中的作用是

___________________________________________________________。(2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织去菌后进行植物组织培养，培养基中需加入______进行筛选，此物质属于氨基糖苷类抗生素，它能抑制蛋白质在叶绿体和线粒体中合成，使植物的光合作用和________受到干扰，从而引起植物细胞死亡。(3)愈伤组织是一种相对没有分化的________团，经液体悬浮培养可以分散成胚性单细胞，在适宜的培养基中，这种单细胞可以发育成__________，再继续发育成转基因玉米株系。[解析]

(1)启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，能驱动基因的转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，则需要强启动子，因此应优先选用BamHⅠ和SacⅠ酶组合，将Ti质粒切开后构建重组表达载体。农杆菌中Ti质粒上的T­DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此T­DNA在该实验中的作用是将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上。(2)由图可知，标记基因是G418抗性基因，因此将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织去菌后进行植物组织培养，培养基中需加入G418进行筛选，此物质属于氨基糖苷类抗生素，它能抑制蛋白质在叶绿体和线粒体中合成，其中叶绿体是光合作用的场所，线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所，因此其可使植物的光合作用和呼吸作用(能量代谢)受到干扰，从而引起植物细胞死亡。(3)愈伤组织是一种相对没有分化的薄壁细胞团，经液体悬浮培养可以分散成胚性单细胞，在适宜的培养基中，这种单细胞可以发育成胚状体，再继续发育成转基因玉米株系。[答案]

(1)RNA聚合酶BamHⅠ和SacⅠ将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上(2)G418呼吸作用(能量代谢)

(3)薄壁细胞胚状体[针对训练]1．(2023·湖北高考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(

)A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B．若用Pvu

Ⅰ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用Sph

Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D．若用Sph

Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落解析：若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因不受影响，在含Tet培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可分离大小不同的DNA分子，若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp的培养基中能形成菌落，不能在含Tet的培养基中形成菌落，D错误。答案：D

2．将小菜蛾细胞的羧酸酯酶基因(CarE)导入水稻细胞，培育抗农药水稻新品种，过程如图所示。下列叙述错误的是

(

)A．必须将含CarE基因的质粒导入水稻的受精卵B．构建重组质粒时，应选用PstⅠ和SmaⅠ分别切割质粒和含CarE基因的DNAC．Tetr的作用是鉴别和筛选含CarE基因的细胞D．通过检测表达产物来判断CarE基因在水稻细胞中是否发挥功能作用解析：不一定要将含CarE基因的质粒导入水稻的受精卵，但是导入受精卵效果要好，A错误；Tetr是标记基因，是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，C正确。答案：A

知能集成(二)

PCR技术中引物的相关问题分析1．PCR技术和DNA复制的比较项目PCR技术DNA复制场所体外(PCR扩增仪中)细胞内(主要是细胞核内)解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化酶耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶温度条件在较高温度下进行需控制温度细胞内温和条件合成对象DNA片段DNA分子相同点均需要模板(DNA双链)、原料(四种脱氧核苷酸)、能量2.与引物相关的问题归纳概括(1)PCR技术需要引物的原因DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。(2)PCR扩增中需要引物数目的计算规律若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗引物数为2n＋1－2，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。[典例]

IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKK基因编码区第1183位碱基T突变为C，导致IKK上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员利用纯合野生鼠应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠(纯合)，主要过程如图1、2。分析回答：(1)在PCR反应体系中，除加入引物、IKK基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入_______________________________________________等。(2)在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物：引物A5′-­CCCCAACCGGAAAGTGTCA­-3′(下划线字母为突变碱基)引物B5′­-TAAGCTTCGAACATCCTA­-3′(下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列)引物C5′-­GTGAGCTCGCTGCCCCAA­-3′(下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列)则PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有__________和图中大引物的________(填“①”或“②”)链。(3)PCR的反应程序为：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃50s,30个循环。在循环之前的94℃3min处理为预变性；循环中72℃处理的目的是__________________________________。(4)据图2分析代孕母鼠对移入子宫的胚胎基本不发生免疫反应，这为________________________提供了可能。(5)研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0，并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因，请你设计完成获得SCID模型鼠的实验步骤：①杂交亲本：______________，杂交得F1；②F1雌雄鼠随机交配得F2；③提取F2每只小鼠的基因组DNA，采用分子生物学方法，利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选，则___________________________________为模型鼠。[解析]

(1)在PCR反应体系中，除加入引物、IKK基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入耐高温DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸等。(2)在PCR1中，获取的是大引物，大引物中含有突变基因，所以应含有引物A，在基因的右端有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B；在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，在它从5′到3′的序列的开始部位应含有限制酶SacⅠ识别的序列，所以要用到引物C；而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′到3′端的序列中开始部位应含有HindⅢ识别的序列，从图中看，它是大引物的②链。(3)在PCR循环之前的94℃3min处理为预变性，使DNA双链解开；循环中72℃处理的目的是使Taq酶从引物起始通过碱基互补配对进行互补链合成。(4)代孕母鼠对移入子宫的胚胎基本不发生免疫反应，这为胚胎在受体内存活提供了可能。(5)①研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0，并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因，若要获得SCID模型鼠，可让F0与野生鼠杂交得F1；②F1雌雄鼠随机交配得F2；③模型鼠中应含有突变基因，但不含IKK基因，故提取F2每只小鼠的基因组DNA，利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选，若IKK基因探针检测未出现杂交带，突变基因探针检测出现杂交带的则为模型鼠。[答案]

(1)Taq酶(或热稳定DNA聚合酶)、4种脱氧核苷酸(2)引物A和引物B引物C

②

(3)使Taq酶从引物起始进行互补链合成(4)胚胎在受体内存活(5)①F0×野生鼠③IKK基因探针检测未出现杂交带，突变基因探针检测出现杂交带[针对训练]1．农杆菌Ti质粒上的T­DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T­DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T­DNA插入的具体位置。下列说法错误的是

(

)注：子链从引物的3′端开始延伸。A．PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T­DNA的插入位置解析：PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理，是体外扩增DNA的一种方式，A正确；PCR中变性过程需要在高温条件下进行，故进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶，B正确；由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T­DNA的插入位置，D正确。答案：C

2．某科研人员从苏云金芽孢杆菌中获取Bt毒蛋白基因，并将其导入大豆叶肉细胞，培育出抗虫的转基因大豆，主要过程如图。请回答下列问题：(1)为了正确扩增Bt毒蛋白基因，并能与图中质粒正确连接，需根据__________、____________________________________设计两种引物。PCR时引物的作用是______________________________________________。(2)根据PCR扩增产物_______________不同，可以用__________________________技术鉴定。结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能的原因有________(填选项)。解决方案一般是在目的基因的__________(填“内部”或“上、下游”)重新设计引物进行PCR。A．引物特异性不强

B．复性温度过低C．模板DNA污染

D．引物碱基序列过长(3)图中①为

，请写出HindⅢ和BamHⅠ的识别序列分别是____________________、__________。①②过程所需要用到的酶有____________________。(4)过程③