艾滋病筛查实验室标准操作规程

艾滋病筛查实验室标准操作规程人类免疫缺陷病毒抗体检测（酶联免疫法）科华生物操作方法：将试剂盒平衡至室温，取出所需的条板，剩余的即时封存。用去离子水合蒸馏水25倍稀释浓缩洗涤液。将所需数量的条板固定于支架按顺序编号设置样品孔、外部对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔每次实验需设外部对照阳性对照2孔、阴性对照1孔。在样品孔中加入100ul待测样品，阴性、阳性对照及外部对照每孔加入100ul，轻拍混匀。置37℃温育60分钟。置洗板机用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。每孔加入100ul酶标记物，轻拍混匀，置37℃温育30分钟。重复步骤⑥。在所有孔内加显色A、显色B剂各50ul，轻拍混匀，置37℃避光温育30分钟。每孔加入50ul终止液终止显色反应，用酶标仪（双波长450nm/630nm）测定各孔A值。结果判定：临界值Cutoff＝0.1﹢阴性对照的平均A值（阴性对照的平均A值小于0.08按0.08计算，大于0.08按实际值计算），样品的A值≥Cutoff值为艾滋病抗体阳性；样品的A值〈Cutoff值为艾滋病抗体阴性。同时满足以下条件的实验是有效的。NC<0.080PCx>0.8，抗-艾滋病-2阳性对照OD值>0.3双波长读数，显色剂空白≦0.040，单波长读数，显色剂空白≦0.080.计算COV：COV=PCxX10%（若PCx>2.5按2.5计算）初筛阳性者应重新取样进行双盲复试，复试阳性者应按照“全国艾滋病检测管理规范”送艾滋病确认实验室进行相关确认试验。

万泰生物操作方法：配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。编号：将样品对应微孔板按序号编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照1型，2型各1孔，空白对照1孔。（用双波长检测，可不设空白对照孔）。加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴性，阳性对照100ul.温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量拧干。加酶：每孔加入酶标试剂100ul，空白孔除外。温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育30±1分钟。洗板：操作同步骤5.显色：每孔加入显色剂A，B液各50ul，轻轻振荡混匀，37±1℃避光显色30±1分钟。测定：每孔加终止液50ul，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处（建议用双波长450nm/600-650nm），用空白孔凋零后测定各孔A值。结果判读：阴性对照孔A值≤0.10，阳性对照孔A值≥0.80，否则实验无效。若有1孔阴性对照A值大于0.1应舍弃；若两孔或两孔以上阴性对照A值大于0.1，实验无效。阴性判定：样品A值＜临界值（CUTOFF）者为艾滋病抗体阴性。阳性判定：样品A值≥临界值（CUTFF）者为艾滋病抗体阳性（注意：初试阳性应重新取样双孔复试。复试阳性者按《全国艾滋病检测技术规范》送艾滋病确证实验室进行确证实验。）

丙型肝炎病毒抗体检测（酶联免疫法）操作步骤：配液：浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔（空白对照孔只加稀释液不加样品及酶标试剂）其余各孔加入100UL样本稀释液。加样：分别在相应孔中加入待测样品，阴，阳对照10微升，轻轻振荡混匀。温育：用封版膜封版后，置37oc温育60分钟。洗涤：揭掉封版膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量拧干。加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶标记抗体100微升，轻轻振荡混匀。温育：置37oc温育30分钟。洗涤：揭掉封版膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量拧干显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振匀，37oc避光显色30分钟。终止：每孔加终止液1滴（50微升），轻轻振荡混匀。测定：10分钟内测定结果，设定酶标仪单波长450nm或双波长450nm/600-650nm测定。用空白孔调零点后测定各孔A值。结果判断临界值（CUT/OFF）计算：CUT/OFF=阴性对照孔A均值+0.12。（不足0.02按0.02计算）阳性判定：样品A值≥临界值（CUTOFF）者判定为抗HCV阳性。（注意初试阳性应重新取样双孔复试）阴性判定：样品A值〈临界值（CUTOFF）者判定为抗HCV阴性。

梅毒螺旋体抗体（酶联免疫法）操作步骤：配液：浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔（用双波长检测，可不设空白对照孔）加样：分别在相应孔中加入待测样品，阴，阳对照100微升，轻轻振荡混匀。温育：用封版膜封版后，置37oc温育60分钟。洗涤：揭掉封版膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量拧干。加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶标记抗体100微升，轻轻振荡混匀。温育：用封版膜封板后，置37oc温育30分钟。洗涤：揭掉封版膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量拧干显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振匀，37oc避光显色30分钟。终止：每孔加终止液1滴（50微升），轻轻振荡混匀。测定：10分钟内测定结果，设定酶标仪波长于450nm（建议双波长450nm/600-650nm测定）用空白孔调零点后测定各孔A值。结果判断临界值（CUT/OFF）计算：临界值=阴性对照孔A均值+0.18。阳性判定：样品A值≥临界值（CUTOFF）者判定为TP阳性。（注意：初试阳性应重新取样双孔复试）阴性判定：样品A值〈临界值（CUTOFF）者判定为TP阴性。

乙肝五项操作规程乙型肝炎表面抗原（HBsAg）操作步骤：配液：配制工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释）编号：将样品对应微孔按序编号（共预留阴性对照孔3孔、阳性对照1孔、建议预留空白对照1孔）加样：加入75微升待测样本和阴、阳性对照与反应孔中。温育：用封片纸覆盖反应板后，置37oc温育60分钟。加酶标抗体：取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性、阳性对照孔中加入50微升酶结合物。微孔振荡器或手工轻轻振荡10秒钟。温育：用封片纸覆盖反应板后，置37oc温育30分钟。洗涤：手工：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置20秒，扣去洗涤液，重复5次在吸水纸上拍干。洗板机：将孔内液体甩干。选择5次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振荡匀，用封板纸覆盖反应板后，将反应板放置37oc孵化30分钟。终止：每孔加终止液1滴（50微升），混匀。测定：用酶标仪读数，波长450nm。（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm或630相近的波长）若需扣除显色剂空白，则先用显色剂空白对照孔校零，然后读取各孔OD值。结果判断目测：在白色背景下观察各孔显色情况，有明显黄色者为乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性；无色者为乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性。酶标仪检测：临界值（CUT/OFF）计算：COV:Cut-offValue参考值PC：阳性对照OD值NCx：阴性对照平均OD值。NCx=(NC1+NC2+NC3)÷3检测有效性：NCx≤0.1、PC≥1.0，则检测结果有效。COV=NCx+0.100S：待测样品的OD值，S/COV：待测样本和COV的比值。阳性判定：样品OD值S/COV≥1.0者判定为HBsAg阳性。阴性判定：样品OD值S/COV<1.0者判定为HBsAg阴性。

乙型肝炎表面抗体（抗-HBs）、操作步骤：配液：浓缩洗涤液配置前充分混匀（如有结晶析出应充分溶解），将浓缩洗涤液（20*）用蒸馏水或去离子水按1:19稀释后使用。编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂）加样：分别在相应孔中加入待测样品50微升和阴，阳对照50微升及质控血清。加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶结合物50微升，轻轻振荡混匀。温育：置37oc温育30分钟。洗涤：手工：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，扣去洗涤液，重复5次在吸水纸上拍干。洗板机：将孔内液体甩干。选择4次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振匀，37oc避光显色15分钟。终止：每孔加终止液1滴（50微升），混匀。测定：用酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm）测定各孔OD值先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。结果判断目测：在白色背景下观察核孔显色情况，有明显黄色者为乙型肝炎表面抗体（抗－HBs）阳性；无色者为乙型肝炎表面抗体（抗－HBs）阴性。酶标仪检测：临界值（CUT/OFF）计算：COV=阴性对照平均OD值×2.1。（阴性对照孔OD值低于0.05者按0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。阳性判定：样品的OD值大于或等于COV值时，说明HBsAg阳性。阴性判定：样品OD值小于COV值时，说明为HBsAg阴性。

乙型肝炎核心抗体（抗-HBc）操作步骤：配液：浓缩洗涤液配置前充分混匀（如有结晶析出应充分溶解），将浓缩洗涤液（25*）用蒸馏水或去离子水按1:19稀释后使用。编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂）加样：将待测样本用生理盐水1:30稀释。（稀释样本检测结果为临床意义；样本原液加样，检测结果为流行病学意义。用户可根据实际情况选择。）分别在相应孔中加入稀释样本50微升和阴，阳对照50微升及质控血清。加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶结合物50微升，轻轻振荡混匀。温育：置37oc温育30分钟。洗涤：手工：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置20秒，扣去洗涤液，重复5次在吸水纸上拍干。洗板机：将孔内液体甩干。选择4次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振匀，37oc避光显色15分钟。终止：每孔加终止液1滴（50微升），混匀。测定：用于酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm）测定各孔OD值先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。结果判断目测：在白色背景下观察核孔显色情况，有明显黄色者为乙型肝炎表面抗体（HBcAb）阳性；无色者为乙型肝炎表面抗体（HBcAb）阴性。酶标仪检测：临界值（CUT/OFF）计算：未稀释样品CUT/OFF=阴性对照孔OD均值N×0.3。1:30稀释样品CUT/OFF=阴性对照孔OD均值N×0.5。阳性判定：样品OD值小于COV，说明该样品HBcAb阳性。阴性判定：样品OD值大于或等于COV，说明该样品HBcAb阴性。

乙型肝炎e抗原（HBeAg）操作步骤：配液：浓缩洗涤液配置前充分混匀（如有结晶析出应充分溶解），将浓缩洗涤液（25*）用蒸馏水或去离子水按1:19稀释后使用。编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂）加样：分别在相应孔中加入待测样品50微升和阴，阳对照50微升及质控血清。加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶结合物50微升，轻轻振荡混匀。温育：置37oc温育30分钟。洗涤：手工：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置浸泡30～60秒，扣去洗涤液，重复5次在吸水纸上拍干。洗板机：将孔内液体甩干。选择4次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升），轻轻振匀，37oc避光显色15分钟。终止：每孔加终止液1滴（50微升），混匀。测定：用于酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm）测定各孔OD值先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。结果判断目测：在白色背景下观察各孔显色情况，有明显黄色者为乙型肝炎e抗原（HBeAg）阳性；无色者为乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴性。酶标仪检测：临界值（CUT/OFF）计算：CUT/OFF=阴性对照孔OD均值N×2.1。（阴性对照孔OD值低于0.05者按0.05计算，高于0.05按实际OD值计算）阳性判定：样品OD值大于或等于COV值时，说明该样品HBeAg阳性。阴性判定：样品OD值小于COV值时，说明该样品HBeAg阴性。

乙型肝炎e抗体（抗-HBe）操作步骤：配液：浓缩洗涤液配置前充分混匀（如有结晶析出应充分溶解），将浓缩洗涤液（25*）用蒸馏水或去离子水按1:19稀释后使用。编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂）加样：分别在相应孔中加入待测样品50微升和阴，阳对照50微升及质控血清。加酶标抗体：空白对照孔不加酶标试剂，每孔加入酶结合物50微升，轻轻振荡混匀。温育：置37oc温育30分钟。洗涤：手工：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置20秒，扣去洗涤液，重复5次在吸水纸上拍干。洗板机：将孔内液体甩干。选择4次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。显色：每孔加入显色剂A，B液各1滴（50微升