(高清版)DB32∕T 4395-2022 小麦土传病毒病病原检测技术规程

小麦土传病毒病病原检测技术规程Codeofpracticefordetectionofpathogenofsoil-bornewheatviral发布I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省作物标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：江苏省农业科学院、宁波大学、江苏省植物保护植物检疫站。1CWMV:中国小麦花叶病毒(ChineseWheatMosaicVirus)Dot-ELISA:斑点酶联免疫吸附剂测定(DotEnzyme-linkedImmunosorbentAssay)ELISA:酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay)间接ELISA:间接酶联免疫吸附剂测定(IndirectEnzyme-IinkedImmunosorbentAssay)PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)RT-PCR:逆转录-聚合酶链式扩增反应(ReverseTranscription-WYMV:小麦黄花叶病毒(WheatYellowMosaicVirus)4原理4.1间接ELISA原理可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。颜色反应的深浅与受检样品中抗原的量呈正比，24.3RT-PCR原理将逆转录(RT)和聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。逆转录是在逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成与之互补的DNA(complementaryDNA,cDNA)的过程，再利用特异性引物以cDNA为模板在DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，依据是否能扩增出目的片段大小的PCR产物进田间采集疑似小麦黄花叶病和中国小麦花叶病产物长度为182bp的小麦样品则认定为感染CWMY的阳性样品；则认定为阴性样品，阳性样品和阴性样品存放于-80℃低温冰箱；间接酶联免疫吸附剂测定和斑点酶6间接ELISA6.1取样待检测样品按1:10(克：毫升)加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，8000r/min离心3min,上清3100μL,加盖，37℃孵育1h或4℃冰箱孵育过夜，每个样品重复3次。孵育结束后，用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PBST)清洗酶标板3次~5次。每孔每次加PBST洗液6.5加抗血清用相应病毒抗血清和抗体稀释缓冲液按照1:2000的比例稀释，每孔加入稀释好的抗体液同6.4。的OD₅值<0.15,阴性对照孔的OD₄05值<0.15,当阴性对照孔的OD4₀5值<0.05时，按0.05计算。阳6.12.2在满足了6.12.1质量控制要求后，可根据如下数据判断结果：样品OD4o₅值/阴性对照OD405值>2,判为阳性；样品OD4o₅值/阴性对照OD₅<2,判为阴性；样品OD₄05值阴性对照OD45值在47.1取样待测样品和对照样品按1:10(克：毫升)加入硫化铅(PBS)磷酸盐缓冲液，用研钵研磨成浆，8000r/min离心3min,上清液即为制备好的检测样品。对照样品做相同处理。预先用铅笔将硝酸纤维素膜划成7mm×7mm大小的正方格，分别取2μL7.2中制备好的待检测用相应病毒抗血清和抗体稀释缓冲液按照1:2000的比例稀释，并将硝酸纤维素膜浸入其中，室将平皿中抗体液倒出，加入PBST20mL洗膜3次～4次，每次3min。7.8显色显色底物氯化硝基四氮唑兰(NBT)66μL和BCIP33μL加到10mL底物缓冲液中混匀，洗好的7.9结果8.1植物总RNA提取MiniKit)的操作步骤提取病叶RNA,然后在紫外分光光度计上测定所提RNA的浓度和纯度。5参照FirstStrandcDNA加入RNaseFreeH₂O至液体总体积为12μL,混匀后于PCR仪中，65℃反应5min后迅速冰浴RT反应液的配制：向变性后的RNA中加入5×M-MuLVbuffer4μL,10mol/LdNTP2μL,RNaseInhibitor(40U/μL)1μL,M-M于-20℃备用或进行后续PCR。termix10μL,上游引物0.5μL,下游引物0.5μL,cDNA1μL,ddH₂O8μL,于PCR仪中扩增。PCR反应程序：95℃3min;95℃15s,58℃15s,72℃30s(30个循环);72℃,6(规范性)间接ELISA试剂氯化钠(NaCl)8.0g,磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g,磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.15g,氯化钾(KCD0.2g,0.5mLTween-20,溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.4,蒸馏水定容PVP(MW24～4000)2g,脱脂奶粉1g,溶解于100mLPBST中。A.4抗血清病毒特异性抗体，抗体效价：1:2000,-20℃保存。碱性磷酸酶标记抗体，抗体效价：1:2000,-20℃保存。二乙醇胺9.7mL,氯化镁(MgCl₂)0.01g,溶解于80mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至9.8,用蒸馏A.7底物溶液(现配现用)1mgPNPP(对-硝基苯磷酸钠)溶于1mL底物缓冲液中。7(规范性)Dot-ELISA试剂氯化钠(NaCD8.0g,磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g,磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.15g,氯化钾(KCD)氯化钠(NaCD)8.0g,磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g,磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.15g,氯化钾(KCD)0.2g,0.5mLTween-20,溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至7.4,蒸馏水定容至1000mL。B.3封闭液取脱脂奶粉5g加入到100mLPBST,充分溶B.4抗血清病毒特异性抗体，抗体效价：1:2000,-20℃保存。碱性磷酸酶标记抗体，抗体效价：1:2000,-20℃保存。钠调节pH至9.5,