大学-师范类-化学专业-仪器分析学科-第三章高效液相色谱法

第3章

高效液相色谱分析

HighperformanceLiquidChromatography(HPLC)

InstrumentalAnalysis内容

§3-1高效液相色谱分析概述§3-2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素§3-3主要类型及其分离原理§3-4液相色谱法固定相

§3-5液相色谱法流动相§3-6高效液相色谱仪

应用HPLC§3-1概述高效液相色谱法是以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱法的理论和实验技术建立起来的一种液相色谱分析法。HPLC一、HPLC与经典液相色谱法的差别

柱内径1～3cm固定相粒径

>100μm流动相驱动方式重力或低压泵HPLC经典LCHPLC3-10μm高压泵<10μm速度快柱效高二、HPLC与GC差别1、流动相GC：流动相为惰性气体HPLC：流动相为液体2、操作条件差别

GC：加温操作

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）HPLC3．分析对象不同

GC：分析易气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%HPLC：分析溶解后能制成溶液的样品；分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%三、HPLC的特点（1）高压（2）高速（3）高效（4）高灵敏度四、HPLC的应用只要试样能制成溶液的物质原则上都可用HPLC法进行分离，分析。尤其适合于那些不宜用GC分析的难挥发物质，热不稳定物质，离子型物质和生物大分子等。

概述§3-2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素理论基础热力学理论：塔板理论动力学理论：速率理论HPLCGC：速率理论方程A：涡流扩散项B/u：分子扩散相

Cu：传质阻力项HPLC一、液相色谱速率理论

——影响色谱扩展的因素HPLC

涡流扩散项？

分子扩散相？传质阻力项？1、涡流扩散项He

dp——固定相颗粒的平均直径

λ——填充不均匀因子

故要减小He，提高柱效，应采用小颗粒固定相并填充均匀。HPLC

cd

：常数

Dm

：分子在流动相中的扩散系数

u:流动相流速

Dm

一般很小，当u较大时，Hd很小，Hd可忽略2、分子扩散相Hd（纵向扩散项）HPLC3、传质阻力项

HPLC

（1）固定相传质阻力项

df——固定液的液膜厚度

Ds——试样分子在固定液内扩散系数

Cs——与容量因子有关的系数故要减小Hs，提高柱效，应使用液膜厚度小的固定相，具有扩散系大的固定液及低流速。

HPLC（2）流动相传质阻力项①流动的流动相中传质阻力项Hm

Dm——试样分子在固定液内扩散系数（与试样粘度成反比，与温度成正成比）故要减小Hm，提高柱效，应采用小颗粒固定相，低粘度流动相、低流速。

HPLC固定相颗粒体积越大，微孔越深，传质越慢，色谱峰扩展越严重。故要减小Hsm,提高柱效，应采用小颗粒，微孔浅孔径越的固定相及低流速。

②滞留流动相的传质阻力项Hsm

HPLC由柱内色谱峰扩展所引起塔板高度变化可归内为：

HPLC可简写为着H=He

+Hd+HS+HMM+HSM忽略分子扩散项小结降低塔板高度，提高柱效及分离效果的方法：

①减小固定相的颗粒直径；②降低流动相的粘度；③在一定范围内减小流动相线速；HPLC二、影响分离的因素——流速HPLC：

H～u图HPLCGC：H～u图在液相色谱中，使用较高流速，柱效不会明显下降，故可采用高流速进行快速分析。三、柱外展开（柱外效应）HPLC柱外展宽：色谱柱外各种因素引起的色谱峰扩展。例如：进样系统连接管检测器的死体积§3-3主要类型及其分离原理一、液—液色谱法二、液—色固谱法三、离子对色谱法四、离子交换色谱法五、离子色谱法六、空间排阻色谱法HPLC一、液-液分配色谱法

1、固定相固定相：担体+固定液（物理或机械涂渍法）

固定液的选择：相似相溶原则

固定液与流动相互不相溶常用的固定液：，—氧二丙腈（ODPN）聚乙二醇（PEG）十八烷（ODS）角鲨烷HPLC2、分离原理：由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，故根据组分在两相间的分配系数不同来分离的。因此，要达到好的分离效果，既要选择合适的固定相，也要选择合适的流动相。HPLCK不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关3、液液分配色谱的分类：根据固定液与流动相的相对极性强弱不同可分为：（1）正相色谱法：

固定液极性>流动相极性

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分（2）反相色谱法：

固定液极性<流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分HPLC4、化学键合固定相（1）化学键合固定相的定义：

利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。

HPLC（2）键合固定相的制备ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷非极性硅烷化反应键合固定相类型疏水基团烷烃（C8和C18）、苯基等极性基团丙氨基氰乙基醚和醇等离子交换基团胺基、季铵盐磺酸、羧酸（3）键合固定相的特点①柱效高；

②无固定液流失③应用范围广；④有利于梯度洗脱。

。保留时间：<例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。没食子酸3,4-二羟基苯甲酸固定相:非极性;流动相:极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸<没食子酸二、液—固吸附色谱法

（liquid-solidadsorptionchromatograph）1、固定相固定相：吸附剂（多孔的固体颗粒）常用的吸附剂：极性：硅胶（薄壳硅胶、全多孔硅胶）、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛、聚酰胺非极性：

活性碳

HPLC2、分离的原理根据不同组分在吸附剂表面吸附和解吸能力的差异来进行分离的。其作用的机制：溶质分子（X）和溶剂分子（S）对吸附剂表面的竞争吸附。吸附平衡：

Xm+nSa======Xa+nSm

式中：Xm--流动相中的溶质分子；

Sa--固定相中的溶剂分子；

Xa--固定相中的溶质分子；

Sm--流动相中的溶剂分子。

HPLC当吸附竞争反应达平衡时：

K=[Xa][Sm]n/[Xm][Sa]n

式中：K为吸附平衡常数。[讨论]：

K越大，保留值越大。

HPLC例：硅胶（SiO2·H2O）结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心

特性：

1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键物质极性↑，吸附能力↑→强极性吸附中心，不易洗脱2）吸水→失活→105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大→500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力适用：分析酸性或中性物质

3、吸附剂和流动相的选择：

依据被测组分、吸附剂和流动相的性质①.吸附剂的选择

强极性物质——选择弱吸附剂弱极性物质——选择强吸附剂②流动相的选择：

流动相极性↑大，对极性被测组分的洗脱能力↑大应用“相似相溶”原则，根据组分性质、吸附剂的活性，选择适当极性的流动相。4

应用

具有不同官能团的化合物

具有相同官能团，但数量不同的化合物

异构体例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序：邻位<间位<对位邻硝基苯胺间硝基苯胺对硝基苯胺适合分离的物质三、离子对色谱法

1、固定相：与液-液分配色谱中固定相相同

2、方法原理

将一种(或多种)与溶质分子电荷相反的离子

(称为对离子或反离子)加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。

HPLC3、分类：根据流动相和固定相的性质可分为

①

正相离子对色谱法

②反相离子对色谱法例：用反相离子对色谱法分离试样离子X+。

固定相：非极性的疏水(C-18柱)（有机相）

流动相：含有对离子Y-的流动相（水溶液）

分离过程：试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y-X+（呈中性缔合物

，在两相间分配。HPLC例：盐酸吗啡的分析（两性）17-甲基-3-羟基-4，5a-环氧-7，8-二脱氢吗啡喃-6a-醇（盐酸

盐三水合物）分离示意图：33++()+3s3(+疏水性固定相（有机相）+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH离子对mB+ABAmA(s流动相（水相）通式疏水性离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中，存在下述萃取平衡：X+水相+Y-水相X+Y-有机相KXY平衡常数：分配系数可通过调节对离子浓度，改变样品离子的保留值。X+水相+Y-水相X+Y-有机相[X+Y-]有机相[X+]水相[Y-]水相KXY=[X+Y-]有机相[X+]水相D==KXY[Y-]水相4、应用：适用于有机酸、有机碱和离子、非离子混合物的分离，尤其对一些生化试样如核苷、核酸、儿茶酚胺，生物碱以及药物等分离。HPLC四、离子交换色谱法1、分离原理离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子与交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。HPLC2、固定相HPLC①离子交换树脂的结构带有活性基团的网状高分子聚合物骨架活性基团聚乙烯树脂酸性基团碱性基团—SO3H—COOH—N+R3—NR2特殊基团②分类据所含交换基团的性质分为：阳离子交换树脂

强酸型含磺酸基团(R-SO3H)

中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4)

弱酸型含酚基、羧基阴离子交换树脂

强碱含季胺基团[-N+(CH3)3]

弱碱含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2

HPLC阳离子交换树脂阳离子交换阴离子交换3、流动相水相缓冲液+有机溶剂调节选择性的主要参数盐种类及浓度pH值各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快4、应用：离子及可离解的化合物如氨基酸、核酸、蛋白质等

HPLC五、离子色谱法1、分离原理离子交换原理

2、固定相：离子交换树脂3、流动相：电解质溶液

HPLC4、仪器：分离柱：离子交换

抑制柱：消除流动相中强电解质背景离子检测器：电导检测器HPLC淋洗液槽泵进样阀分离柱

电导检测

抑制柱

记录仪输送分离检测数据处理图离子色谱仪流程图5、分离及抑制过程：（1）分离过程（测定样品中X-）交换：

R+-OH-+Na+X-→R+-X-+Na+OH-洗脱：

R+-X-+Na+OH-→R+-OH-+Na+X-

（2）抑制过程

Na+OH-+R--H+→R--Na++H2ONa+X-+R--H+→R--Na++H+X-

HPLC6、应用

离子尤其是阴离子的检测

HPLC六、空间排阻(凝胶)色谱法1、分离原理：基于被分离组分的分子大小和形状不同来实现分离的。2、固定相：

固定相是凝胶，是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔径或立体网状的物质。类似于分子筛的作用。HPLC3、分离过程大分子——不能渗入凝胶的孔穴中,而被排阻，而直接流过色谱柱，最先流出。中等分子——部分渗透，中等速度流过色谱柱小分子——完全渗透，最后流出。样品组分按它们的分子大小被分离，出峰顺序为从大到小。HPLC4、流动相试样的分离并不依赖于溶剂与试样间的相互作用力。溶剂的选择主要是从对样品的溶解能力,溶剂与仪器的匹配以及实验结果处理的方便来考虑的。HPLC5、应用：①可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离②广泛应用于大分子的分级。③非常适合于未知样品的初步探索分离。HPLC*总结：分离类型选择

choiceofseparationtypes§3-5液相色谱法流动相1.流动相特性

(1)液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；

HPLC2.流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；

按极性分：极性、弱极性、非极性；

按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。

常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。3.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)4.选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。§3-6高效液相色谱仪HPLC一、流程及主要部件流程3、分离系统（高效分离柱）

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。1、在高效液相色谱法中，VanDeemter方程中哪项对色谱峰的影响可忽略？【B】A.涡流扩散项B.分子扩散项C.流动区域的流动相传质阻力D.停滞区域的流动相传质阻力2、在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是