高中生物第4章现代生物技术4.3聚合酶链式反应技术课件北师大版选修

第3节聚合酶链式反应技术1.记住PCR技术的原理。2.简述PCR技术的基本操作。3.说出PCR技术的应用。一二三一、DNA片段的扩增1.概念PCR技术是体外酶促合成特定DNA片段的一种方法。2.扩增条件按照DNA复制所需条件,在体外酶促合成DNA时,必须具备待扩增的目的DNA(DNA合成的模板)、合成DNA时所需的特异引物和原料——4种三磷酸脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、起酶促作用的耐热TaqDNA聚合酶和作为反应介质的缓冲溶液。

四一二三3.原理根据DNA的理化特性,在高温条件下,双链DNA解旋变为单链DNA(变性);低温条件下单链DNA又可恢复为双链DNA(复性);中温条件下能进行DNA合成,使DNA链延伸。由此,PCR反应过程一般采取“高温变性——低温复性——中温延伸”三个步骤,促使DNA进行复制。以上述反应作为一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,得到大量的目的DNA片段。四一二三四二、琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便的快速分离、纯化和鉴定DNA的方法。琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔,带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小,因此

大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。一二三四三、DNA片段的扩增和琼脂糖凝胶电泳的方法步骤1.DNA片段的PCR扩增(1)把PCR反应体系的各种药品加入冰浴的EP管中,混合均匀后

低速离心。每管加入30μL无菌石蜡油。(2)将EP管放入PCR热循环仪中,输入并运行反应程序。2.扩增产物的检测制作电泳胶板→加样→电泳→观察。一二三四四、PCR影响因素在PCR实验中,需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间,片段较大,中温延伸的时间就要相应延长;引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择,如果引物越短,A、T含量越多,PCR反应的复性温度就越低,反之引物长度较长,G、C含量较高,则需要设计较高的复性温度。TaqDNA聚合酶在PCR扩增过程中也存在大约为1×10-5的出错概率,而且随着循环数的增加,其活性也逐渐降低。因此,PCR扩增循环次数并非越多越好,一般控制在25~35个循环。一二三四思考：2014年埃博拉疫情在非洲蔓延,随后生物科学研究工作者迅速研制出了埃博拉病毒检测试剂盒,使得能够快速诊断出埃博拉患者。那么,埃博拉病毒检测试剂盒所需的大量埃博拉病毒基因是怎样获得的呢?提示:采用PCR技术对埃博拉病毒的基因迅速扩增产生的。1.PCR技术与DNA的复制PCR反应通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制,所以PCR反应与DNA复制的原理相同,计算方法也大体相同。例如:PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累,其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段。2.PCR的常见问题PCR实验很容易出现假阳性(检测出非目的片段的扩增,而未检测出目的片段的扩增)或假阴性(未检测出任何片段的扩增)的结果。PCR技术高度灵敏,极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增,因此模板DNA的污染是PCR出现假阳性结果的主要原因。此外,样品中存在靶基因的类似序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果,PCR操作时要注意做到隔离操作区,分装试剂,简化操作程序,使用一次性吸头等。出现假阴性结果的常见原因有TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制;引物设计不合理;提取的模板质量或数量不过关、PCR系统的建立欠妥当及循环次数不够,等等。当实验中出现假阴性的情况时,应首先在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶,并增加5~10次循环。为了防止假阴性结果的出现,在选用TaqDNA聚合酶时,要注意用活力高、质量好的酶。尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度的要求不高,但也不允许有机试剂的污染。所以,在提取DNA模板时,应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低,很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况,尤其需要保证引物的3'端与靶基因互补。PCR的原理及应用【例题1】

下列有关PCR的描述,不正确的是(

)A.是体外酶促合成特定DNA片段的一种技术B.引物一般采用人工合成的单链DNA片段C.PCR产物以指数方式增加D.扩增对象是氨基酸序列解析:PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,以四种三磷酸脱氧核苷酸为原料,在引物的作用下使DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸,短时间迅速复制上百万倍的DNA片段,其扩增产物以指数方式增加。答案:D题型一题型二【例题2】

标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步,这三大步需要的温度依次是(

)A.94℃、40℃、72℃

B.72℃、40℃、94℃C.40℃、94℃、72℃

D.80℃、40℃、72℃解析:当温度上升到94~98

℃时,双链DNA变性成单链,称之为变性;当温度迅速下降到40~60

℃时,引物通过碱基互补配对与单链DNA结合;当温度上升到72

℃左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq

DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链,称为延伸。答案:A题型一题型二题型一题型二解析:从土壤中分离微生物的一般流程是土壤取样→制备培养基→分装→制备土壤稀释液→接种培养→观察。该实验步骤没有问题,但在前五步操作中都没有进行无菌操作,因而无法说明分解纤维素的微生物一定来自于土壤。答案:(1)取样工具应提前灭菌;不能用蒸馏水,应用无菌水;该操作应在火焰旁进行。(3)培养基分装并加滤纸条后应灭菌。(4)在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁。(5)接种应在无菌条件下进行。题型一题型二PCR基本操作与产物测定【例题3】

在PCR实验操作中,下列说法不正确的是

(

)A.在扩增产物的检测中需配制质量分数为10%的琼脂糖凝胶,制成电泳胶板B.离心管的盖子一定要盖严,防止液体外溢C.在检测时,需将胶板浸入溴化乙锭溶液染色5~10minD.离心的目的是使反应液集中在离心管底部,提高反应效果解析:在扩增产物的检测中,需配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶,制作成电泳胶板。答案:A12341.有关PCR技术,下列叙述不正确的是(

)A.用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸B.在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似C.PCR反应只需一定的缓冲溶液和DNA模板以及四种三磷酸脱氧核苷酸D.PCR一般经历25~30个循环,每个循环分为变性、复性、延伸答案:C解析:PCR反应中需要的条件有模板(DNA分子)、原料(4种三磷酸脱氧核苷酸)、酶(耐高温DNA聚合酶)、引物和一定的缓冲液等。5612342.引物的作用是(

)A.打开DNA双链B.催化合成DNA子链C.使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始复制DNAD.提供模板答案:C解析:DNA分子的复制具有方向性,即只能从引物的3'端开始,从子链的5'端向3'端延伸。引物的作用是与DNA聚合酶结合促使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始复制DNA。5612343.使用PCR仪进行DNA扩增的具体实验操作顺序应为

(

)①设计好PCR仪的循环程序②按配方准备好各组分③用微量移液器在离心管中依次加入各组分④进行PCR反应⑤离心使反应液集中在离心管底部A.②③⑤④①

B.①⑤③④②C.②③⑤①④

D.④②⑤③①答案:C解析:使用PCR仪进行DNA扩增前,首先按照PCR体系配方,依次将各组分加入离心管离心,使反应液集中于试管底部,然后再设计好PCR仪的循环程序进行PCR反应。5612344.利用PCR技术扩增目的基因的过程中,需加入(

)A.耐高温的解旋酶以保证DNA双链完全解开B.2种已知核苷酸序列的引物以保证核苷酸链的延伸C.4种足量的核糖核苷酸以保证目的基因的扩增D.一定量的盐酸和氢氧化钠溶液以维持pH的稳定答案:B解析:在PCR过程中,解旋是通过加热到94

℃实现的,不需要加入解旋酶。PCR过程中以解开的DNA的两条链为模板,因此需要2种已知序列的引物分别与两条模板链结合(注意由于DNA分子的两条链是反向的,2种引物会分别在DNA的两端与互补的模板链结合)。PCR反应的原料是4种三磷酸脱氧核苷酸。反应溶液体系的pH依靠磷酸缓冲液维持稳定。561234565.要使PCR反应在体外条件下顺利地进行,需要严格地控制(

)A.氧气的浓度

B.酸碱度C.温度

D.大气的湿度答案:C1234566.生物技术的迅速发展,给社会带来了较大的经济效益,受到社会广泛重视。请回答下列生物技术方面的问题。(1)Taq耐热菌的发现和分离为基因工程的发展作出了突出贡献。从培养液或自然环境分离Taq耐