《卵磷脂的分离纯化实验报告》6300字

卵磷脂的分离纯化实验报告目录TOC\o"1-2"\h\u23135卵磷脂的分离纯化实验报告 1260861.1引言 1203491.2实验仪器与试剂 250311.2.1实验材料及试剂 251281.2.2实验仪器 2320561.3实验方法 3204511.3.1卵磷脂标准曲线的绘制及检测方法 314411.3.2乙醇体系萃取卵磷脂 345731.3.3乙醇体系冷冻提取卵磷脂 41821.4实验结果 4260341.4.2乙醇体系萃取过程中不同因素对卵磷脂含量的影响 575721.4.3乙醇体系冷冻过程中不同因素对卵磷脂含量的影响 938641.4.4卵磷脂含量分析 12引言磷脂广泛分布于动植物体内，根据Sn-3位磷酸衍生物的不同分为磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酸（PA）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）。本文主要研究DLPC这一类特异性磷脂酰胆碱的纯化。目前文献中提及到的PC纯化方法多以蛋黄和大豆为原料。尽管蛋黄磷脂中PC含量高于大豆磷脂，但它的Sn-2位主要是饱和脂肪酸。蛋黄PC中DLPC含量并不高，而DLPC是大豆PC的主要组成成分。所以纯化富含DLPC的PC一般选择价格低廉，磷脂含量高的大豆粉末磷脂作为原料。近几年，大豆PC在食品、医药行业应用越来越广泛。针对不同的功能需求相继出现不同改性方法的研究。目前研究较多的有柱层析法、超（亚）临界萃取法、膜分离法、有机溶剂萃取法。其中柱层析法能得到纯度在90%以上的PC，纯化效果最突出，但上样量低，生产效率不高。超（亚）临界萃取法和膜分离法工艺简单、且不引入有毒试剂，但设备及耗材成本高。有机溶剂萃取法操作简易，产量大，成本低，但纯化程度不够高，一般可作为纯化步骤的预处理方法。同时，还存在一些不太热门的PC纯化方法，酶水解法主要用于提取蛋黄卵磷脂，通过水解鸡蛋中的蛋白质的方式提高磷脂含量，无法分离大类磷脂，纯化效果有限；无机盐沉淀法会引入的有毒沉淀剂，难以脱除彻底。而用乙醇冷冻法研究较少，但因其操作方法简单，处理量大，无需借助高成本维护的仪器，可将经预分离的磷脂酰胆碱进一步纯化。因此，乙醇冷冻法可与有机溶剂萃取法结合探索出一种生产高纯度PC的方式。本章内容以大豆粉末磷脂为原料，采用乙醇萃取联合乙醇冷冻法制备高纯度PC，研究乙醇萃取过程中乙醇浓度、料液比、萃取时间、萃取温度、萃取次数对乙醇萃取效果的影响，和乙醇冷冻过程中乙醇浓度、固液比、冷冻时间对冷冻纯化效果的影响。实验仪器与试剂实验材料及试剂表2-1主要材料及试剂名称纯度生产厂家乙腈色谱纯天津市科密欧化学试剂公司甲醇色谱纯上海国药试剂公司85%磷酸色谱纯阿拉丁试剂有限公司乙醇分析纯上海国药试剂公司丙酮分析纯上海国药试剂公司乙醚分析纯上海国药试剂公司大豆粉末磷脂≥97%安徽素之味生物科技有限公司大豆L-α-磷脂酰胆碱标准品≥98%北京百灵威科技有限公司实验仪器表2-2主要仪器名称型号厂家鼓风干燥箱DHG-9140A巩义市予华仪器公司集热式恒温磁力搅拌器DF-101S常州国华电器公司液相色谱仪LC-10F天津博纳艾杰尔公司超声波清洗机SK3300上海科导超声仪器有限公司IKA悬臂搅拌器EUROSTAR40digital德国艾卡仪器设备有限公司分析天平FA2104N奥豪斯（上海）公司旋转蒸发仪YRE2000E巩义市予华仪器公司自动双重纯水蒸馏器SZ-93上海亚荣生化仪器厂快速高低温程序控制恒温槽CK-4010GD宁波新芝生物科技股份有限公司真空干燥箱DZF上海精宏实验设备有限公司InnovaSilica柱5μm4.6×250mm天津博纳尔艾杰尔有限公司实验方法图2-1PC制备工艺流程本章实验具体工艺流程如图2-1所示。卵磷脂标准曲线的绘制及检测方法（1）PC标准曲线绘制分别配制浓度梯度为0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mg/mL的PC标准溶液，过0.22μm尼龙滤膜，待液相分析检测。以PC浓度为横坐标，对应目标峰面积为纵坐标绘制标准曲线。（2）进样溶液配制称取30-50mg待测磷脂于5mL塑料离心管，加少量乙醇超声溶解，后转入25mL容量瓶中，塑料离心管用乙醇润洗3次，润洗液转入25mL容量瓶，最后用乙醇定容待检测。（3）液相检测方法HPLC色谱方法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>张维农</Author><Year>2004</Year><RecNum>266</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[69]</style></DisplayText><record><rec-number>266</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0xfzxasr89f5pgevv5npz2999veze2dzsvrv"timestamp="1617724706">266</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>张维农</author></authors></contributors><titles><title>天然磷脂的置换色谱分离纯化及其脂质体色谱研究</title></titles><dates><year>2004</year></dates><publisher>武汉大学</publisher><urls></urls></record></Cite></EndNote>[69]：检测器为UV检测器，检测波长：203nm；流动相：乙睛:甲醇:85%磷酸=180:3:1（V/V/V）；流量：0.5mL/min；色谱柱：InnovaSilica5μm4.6×250mm；柱温：24°C；进样量：20μL。乙醇体系萃取卵磷脂取20g大豆粉末磷脂于150mL或100mL烧杯中，根据固液比加入不同体积不同浓度的乙醇溶液。在不同温度下250r/min水浴搅拌，萃取不同次数，取上清液转入100mL圆底烧瓶中，50°C真空脱溶，脱溶物用10mL丙酮洗涤3次后真空脱溶去除丙酮，得到粗提PC。此时产品PC含量不足90%，粗提PC需经过乙醇冷冻法进一步提纯。得率计算公式如下：式2.1粗提PC得率=粗提PC质量大豆粉末乙醇体系冷冻提取卵磷脂优化乙醇冷冻实验条件需要大量的粗提PC，以下为获取冷冻法原料的操作方法：取500g粉末磷脂于2L烧杯中，选择2.3.2优化得到的乙醇萃取条件萃取大豆粉末磷脂。经旋蒸后的粗提PC质地粘稠，附着于圆底烧瓶瓶壁，不易取出。将150mL乙醚分三次加入圆底烧瓶超声溶解并反复冲洗，乙醚磷脂溶液转移至1L烧杯，45°C水浴30min，挥干部分乙醚。加入750mL丙酮使磷脂沉淀。倒掉上清液，将沉淀平铺于表面皿，50°C真空干燥24h，得到粗提PC。取10g粗提PC于100mL旋盖试剂瓶中，根据固液比加入不同体积不同浓度的乙醇溶液，60°C水浴溶解，置于高低温程序控制恒温槽中，1h内从60°C降温至-7°C，保温不同时间。取上清液，50°C旋蒸去除溶剂，得到制备PC。得率计算公式如下：式2.2制备PC得率=制备PC质量粗提PC质量×10实验结果卵磷脂标准曲线图2-2PC的标准曲线以PC的浓度为横坐标，目标峰面积为纵坐标，绘制的标准曲线如图2-2所示，PC标准曲线方程为y=16395145.6254x+571837.0205，R²=0.9997。乙醇体系萃取过程中不同因素对卵磷脂含量的影响为了得到乙醇体系萃取PC的最优条件，通过单因素实验对各个影响因子进行探讨。本实验考察乙醇浓度（%）、固液比（g/mL）、萃取时间（min）、萃取温度（°C）和萃取次数这些因素对PC含量的影响，以粗提物PC含量（%）和得率（%）作为考察指标。乙醇浓度对乙醇萃取效果的影响图2-3乙醇浓度对乙醇萃取PC含量和得率的影响固定实验条件：固液比1:4（g/mL），萃取时间30min，萃取温度60°C，萃取次数1次。探索80%、85%、90%、95%、100%浓度乙醇对乙醇萃取PC含量和得率的影响。磷脂在乙醇和水中溶解度不同，不同乙醇-水比例的溶液萃取PC的效果也会有差异。PC在乙醇中溶解度远高于其他磷脂，水分添加过量会降低PC的溶解性，同时溶解更多如PA、PE这一类比PC水溶性更强的磷脂，使PC含量降低。故本章只对80%以上乙醇浓度的萃取结果进行探讨。具体结果如图2-3所示。由图2-3可看出，乙醇浓度在80-95%时，PC含量和得率随着乙醇浓度增加而逐渐上升。因为此时PC在溶液中的溶解度高于其他磷脂，同时水分的添加促使磷脂与其结合形成胶体，磷脂在搅拌萃取过程中结团成块，不利于磷脂与溶剂体系接触，造成了水分添加而PC含量降低的现象。当乙醇浓度大于95%时，PC含量和得率反而随着乙醇浓度的增加而降低。可能是因为少量水分的添加降低了乙醇-水溶液的黏度，使体系的传质效率增加ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王成涛</Author><Year>2010</Year><RecNum>265</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[70]</style></DisplayText><record><rec-number>265</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0xfzxasr89f5pgevv5npz2999veze2dzsvrv"timestamp="1617724706">265</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>王成涛</author></authors></contributors><titles><title>大豆磷脂制备高纯度磷脂酰胆碱的研究</title></titles><dates><year>2010</year></dates><publisher>河南工业大学</publisher><urls></urls></record></Cite></EndNote>[70]，促进了除PC磷脂的溶解，而此时PC的溶解速率上升缓慢甚至可能低于95%乙醇浓度时PC的溶解速率，导致在无水乙醇体系下PC含量得率均低于95%乙醇浓度体系。因此选择95%乙醇浓度进行下一步因素的探索，该条件下PC含量为76.2%，得率为21.5%。固液比对乙醇萃取效果的影响图2-4固液比对乙醇萃取PC含量和得率的影响固定实验条件：乙醇浓度95%，萃取时间30min，萃取温度60°C，萃取次数1次。探索1:1.5、1:2、1:4、1:6、1:8固液比（g/mL）对乙醇萃取PC含量和得率的影响。PC含量与PC在溶液中的浓度和是否处于饱和状态有直接关系，探索不同固液比对PC以及其他磷脂在溶液中的浓度影响可通过PC含量和得率来反映。选择合适的固液比，观察PC从饱和状态到浓度逐渐变低的含量趋势至关重要。因为固液比在1:1（g/mL）时，固体含量过高，难以在搅拌时均匀分散在溶液中，故选择固液比范围为1:1.5-1:8（g/mL）。由图2-4可知，固液比范围在1:1.5–1:2（g/mL）时，PC含量随溶液体积的增加而上升。该过程中固比为1:1.5（g/mL）时，溶液中PC过度饱和，多数PC未溶解，乙醇溶液增加时，PC与其他磷脂的溶解差异变大，使得PC含量提高。固液比范围在1:2–1:8时，随着溶液体积的增加，PC含量随之下降，而得率逐渐上升。萃取溶液用量低于实验萃取常用量，一般多数文献中乙醇萃取PC固液比范围在1:4-1:20，造成PC含量随溶液体积增加而下降的现象。此时PC在溶液中的浓度远低于饱和度，而乙醇-水溶液的添加会溶解更多其他磷脂，导致PC含量越来越低。磷脂整体溶解质量随溶液体积增加而增加，故PC得率呈现一直上升的趋势。根据图2-4可知，固液比为1:2（g/mL）时，纯度最高，与固液比1:4（g/mL）相比PC含量高约4%，得率低约2%。综合考虑，选择固液比1:2（g/mL）最佳，该条件下PC含量为80.0%，得率为19.2%。萃取时间对乙醇萃取效果的影响图2-5萃取时间对乙醇萃取PC含量和得率的影响固定实验条件：乙醇浓度95%，液比1:2（g/mL），萃取温度60°C，萃取次数1次。探索10min、20min、30min、40min、50min萃取时间对乙醇萃取PC含量和得率的影响。萃取时间过短，PC未溶解完全，得率低。萃取时间过长，容易提高其他磷脂溶解量。因此需要选择一个适合的萃取时间得到可观的PC含量和得率。由图2-5可知，萃取时间在20-40min时，PC含量随着时间的推移而上升。此时溶液中PC未达到饱和，同时PC的溶解和扩散需要时间，此时PC含量与萃取时间成正比。而萃取时间在10-20min和40-50min时，PC含量随时间增加而下降，而PC得率上升。因为在这段时间内，磷脂中PE等其他磷脂组分的溶解速率大于PC，导致了PC含量的下降。根据图2-5可知萃取时间为40min时，PC含量最高，且得率仅比萃取50min时低0.5%。该条件下PC含量为80.3%，得率为22.1%。故选择萃取时间为40min佳条件。萃取温度对乙醇萃取效果的影响图2-6萃取温度对乙醇萃取PC含量和得率的影响固定实验条件：乙醇浓度95%，固液比1:2（g/mL），萃取时间40min，萃取次数1次。探索30°C、40°C、50°C、60°C萃取温度对乙醇萃取PC含量和得率的影响。乙醇萃取过程中，温度的改变会影响溶液的黏度及磷脂的传质速率，从而影响最终萃取效果。从工业生产的角度考虑，萃取温度过高，会促进磷脂的氧化，增大设备耗能，萃取温度过低，会降低萃取效率，因此要挑选一个合适的温度范围对萃取效果进行探索。由图2-6可知，在温度范围为30-50°C时，随着温度升高，PC含量和得率上升，原因是该温度范围下，体系温度升高，乙醇溶液粘度降低，磷脂各组分传质速率增大，扩散系数增加，PC的溶解效率提高ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>葛玉卿</Author><Year>2004</Year><RecNum>262</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[71]</style></DisplayText><record><rec-number>262</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0xfzxasr89f5pgevv5npz2999veze2dzsvrv"timestamp="1617724706">262</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>葛玉卿</author></authors></contributors><titles><title>大豆磷脂酰胆碱的提取纯化研究</title></titles><dates><year>2004</year></dates><publisher>中南大学</publisher><urls></urls></record></Cite></EndNote>[71]。当温度高于50°C时，PC含量和得率随着温度的升高而下降，此时温度的升高促使磷脂与水和乙醇乳化，开始凝结成团，分散性降低，不易搅拌；同时，温度的升高更有利于磷脂其他组分的溶解，导致最后PC含量和得率降低。萃取温度为50°C时PC含量和得率最高，因此选择该条件作为最优条件，PC含量为83.8%，得率为23.2%。（5）萃取次数对乙醇萃取效果的影响图2-7萃取次数对乙醇萃取PC含量和得率的影响固定实验条件：乙醇浓度95%，固液比1:2（g/mL），萃取时间40min，萃取温度50°C。探索1次、2次、3次、4次、5次萃取次数对乙醇萃取PC含量和得率的影响。萃取PC的过程中，仅萃取一次并不能将磷脂中的PC提取完全，从生产的角度考虑，往往要选择高得率和萃取溶剂的消耗量低的实验条件，确定合理的萃取次数。由图2-7可知，相比萃取1次，萃取次数为2次时PC含量和得率更高，因为只萃取1次时，磷脂沉淀物中还残留部分PC，经过乙醇-水溶液的再次溶解提高了PC的含量。当萃取次数超过两次时，磷脂沉淀物中PC含量越来越少；此时，溶液溶解磷脂其他组分能力增强，溶解PC能力变弱，得率随着萃取次数的增加而升高。在萃取次数达到4次时，得率的上升趋势接近平缓。综合PC含量、得率和溶剂消耗的考虑，萃取3次时，PC得率上升明显且PC含量仅次于萃取2次的条件，故选择萃取3次作为最优条件，该条件下PC含量为84.4%，得率为36.2%。乙醇体系冷冻过程中不同因素对卵磷脂含量的影响利用低温条件下PC与其他磷脂组分在乙醇溶液中溶解度差异被放大，更多非PC的磷脂组分析出，达到进一步提纯PC的效果。以乙醇萃取法得到的粗提PC作为原料，其中PC含量约为84%。探索乙醇冷冻提取PC的最优条件，通过单因素实验对各个影响因子进行探讨。本实验考察乙醇浓度（%）、固液比（g/mL）、萃取时间（min）对PC中DLPC含量的影响，以制备PC含量（%）和得率（%）作为考察指标。乙醇浓度对冷冻纯化效果的影响图2-8乙醇浓度对冷冻纯化PC含量和得率的影响固定实验条件：固液比1:4（g/mL），冷冻时间24h，冷冻温度-7°C。探索80%、85%、90%、95%、100%乙醇浓度对冷冻纯化PC含量和得率的影响。乙醇溶液中的水在低温下结晶，影响不同磷脂在冷冻过程的析出程度以及在乙醇中的溶解情况。挑选合适的乙醇浓度进行冷冻法有利于提高纯化效果。磷脂通过与水形成胶体结晶析出ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>李桂华</Author><Year>2010</Year><RecNum>263</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[36]</style></DisplayText><record><rec-number>263</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0xfzxasr89f5pgevv5npz2999veze2dzsvrv"timestamp="1617724706">263</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>李桂华</author><author>王成涛</author><author>方芳</author></authors></contributors><titles><title>乙醇冷冻法纯化分离大豆磷脂酰胆碱研究</title><secondary-title>粮食与油脂</secondary-title></titles><periodical><full-title>粮食与油脂</full-title></periodical><pages>17-19</pages><number>05</number><dates><year>2010</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[36]。由图2-8可知，不同含水量条件下，乙醇与不同磷脂组分的结合能力也会发生变化。乙醇浓度范围在85-95%时，PC含量随着乙醇溶液中水分的减少而上升。当溶剂体系完全无水时，PC含量显著降低。原因是在无水时，乙醇溶解PC的能力变差；或者无水时不利于其余磷脂组分的析出。从图2-8可看出，PC含量最低值与最高值相差约4%。因为乙醇浓度对冷冻法纯化效果影响显著。本章实验主要以提高PC含量为目的，乙醇浓度为95%时PC含量最高，故选择95%乙醇浓度作为最优条件，该条件下PC含量为92.4%，得率为58.3%。固液比对冷冻纯化效果的影响图2-9固液比对冷冻纯化PC含量和得率的影响固定实验条件：乙醇浓度95%、冷冻时间24h。冷冻温度-7°C。探索1:2、1:4、1:6、1:8（g/mL）固液比对冷冻纯化PC含量和得率的影响。溶剂的体积决定了溶解磷脂量的多少，不同固液比下各磷脂组分与水和乙醇结合的方式也有所区别，探索固液比对冷冻纯化PC的影响至关重要。由图2-9可知，随着溶液体积的添加，PC得率逐渐上升，但上升的趋势逐渐由明显变为缓慢。因为在一定范围内，溶液体积越大，磷脂的溶解量越大，磷脂析出量越少；同时，溶剂体积的增加意味着PC逐渐脱离饱和状态，磷脂其他组分逐渐在溶液中溶解，导致PC含量降低。图2-9的结果中，固液比为1:2（g/mL）条件下PC含量最高，但此时得率最低。相比之下，固液比为1:4（g/mL）时，PC含量仅低0.8%，且得率高22.6%。为保证实验的经济价值，在提高PC含量的同时还需保证有足够的得率。同时为了满足得率，也不能以牺牲纯度为代价，还要避免过度的溶剂消耗造成成本负担。最后选择固液比1:4（g/mL）作为本因素最优条件，该条件下，PC含量为92.4%，得率为58.3%。冷冻时间对冷冻纯化效果的影响图2-10冷冻时间对冷冻纯化PC含量和得率的影响固定实验条件：乙醇浓度95%、固液比1:2（g/mL）。冷冻温度-7°C。探索8h、12h、16h、20h、24h冷冻时间对冷冻纯化PC含量和得率的影响。乙醇冷冻纯化效果与冷冻时长有很大关联。冷冻时间短，磷脂其他组分未沉淀完全，冷冻时间长可能导致更多PC析出。由图2-10可知，当冷冻时间低于20h时，PC含量随冷冻时间的增加而上升，随着时间的推移，更多其他磷脂组分析出。有文献报道溶液与环境存在温度差时，因温度骤降，饱和度高的其他磷脂会析出，同时夹带部分PC析出ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>李召妍</Author><Year>2010</Year><RecNum>264</RecNum><DisplayText>