DB33T 2408-2021 甘薯茎腐病菌检疫鉴定方法　　

33DetectionandidentificationofDickeyadadantiiI请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别专利的责任。本标准起草单位：浙江省植保检疫与农药管理1甘薯茎腐病菌检疫鉴定方法纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacterales狄克氏菌属（Dickeya）、达旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)。革兰氏阴性细菌，菌体短杆注：症状特征见附录A。4缩略语CFU：菌落形成单位（Colony-FormingCTAB：溴代十六烷基三甲胺（CetyltrimethyDNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacidNTP：脱氧核苷三磷酸（DeoxyribHR：过敏性反应(HypersensitiveReactioionization-timeoffligNA：营养琼脂（NutrientAgar）NGM：营养琼脂甘油培养基（NutrientAgarPCR：聚合酶链式反应（PolymerasechainreactRT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（ReversetranscriptionpolymTaq：水生噬热杆菌（Thermusaquati2根据甘薯茎腐病的菌落形态特征、田间危害症状特征、分子生物学PCR或RT-PCR反应特征、蛋白质7.18MALDI质谱仪：需具有细菌鉴定分析3PCR扩增RT-PCR扩增到喷菌现象，剪取病健交界处3块~5块组后加入1mL生理盐水，室温浸泡15min~30min或4℃冰箱8h以上，取浸泡液12000r/min(离心力培养2d~3d,获得单菌落。液10000r/min(离心力9000g)离心20min,1mL无菌水悬浮沉淀；12000r/min(离心力10000g)三次后，加入100mL生理盐水，室温浸泡1h或4℃冰箱8h以上，浸泡液10000r/min(9000g)离心20min,1mL无菌水悬浮沉淀，悬浮液稀释2个~3个梯度，于NGM或NA平板涂布3个~5个平板分4样品DNA的提取可按CTAB方法，也可使用商品化的DNA提取试剂盒提取。提取的核酸用于PCR检测或对于有症样品，以标准菌株做阳性对照，健康植物组织做阴性对照，双蒸水作为空白对照进行PCR检测，具体检测步骤和判定标准按附录C执行。单菌落可制成菌悬液直接进行P对照为无菌水接种，保湿1d，25℃~30℃,12h/12h生长。接种2d～4d后观察接种位置现症状。根据柯赫氏法则，对发病处组织再分离病菌，对于有症状样品，PCR检测结果为阳性，即判定为检出甘薯茎腐病菌；无症状样品或新发生区的有症状样品，PCR检测结果阳性，且分离到病菌，参考致病性测试结果，判定检出甘薯茎腐病菌。其中，PCR检测可根据实验条件，选择本标准10.2.2或10.2.3的一种进行检测，任意一种检测方法的结果为阳性则判定为PCR检测结果为阳性。分离的疑似甘薯茎腐病菌单菌落鉴定可选用本标准10.2.2或10.2.3或薯茎腐病菌D.dadantii。5送样人联系方式和联系地址、检测时间、地点、方法和鉴定者。疑似症状等应及时拍照保存，PCR检测6(资料性)A.1症状出现黑褐色斑，见图A.1。早期发病全株枯死。中后期发病，在病斑部位上端的藤蔓有不定根深入土中吸取营养而使植株“假健康”,到收获时发现藤蔓基部腐烂变发病斑一般以芽眼为中心圆形，稍凹陷，黑褐色，后逐渐扩大A.2病原菌形态及培养性状病原菌是革兰氏阴性细菌，菌体短杆状，大小约为2.36μm×0.4μm,周生烟草上激发过敏性反应(HR),见图A.3。病原菌煎鸡蛋状，边缘不整齐，表面略凸起，产生靛蓝，直径2mm~3mm,见图A.4的右图。7DB33/T2408—2021A-08-01LA-05-02图A.3烟草过敏性反应8图A.4D.dadantii在培养基上的菌落形态A.3接种症状分离物10°CFU/mL菌悬液针刺接种甘薯藤蔓进行致病性测试。对照为无菌水接种，保湿1d,25℃~30℃生长。接种2d~4d后观察接种位置附近是否出现症状，见图A.5。根据柯赫氏法则，对发病处组织再分离病菌，进行PCR检测。图A.5甘薯藤蔓上的接种症状9B.2.1营养琼脂（BectonDickinsonandCo），72℃延伸5min。反应参数可根据不同仪器的要求作适当调整。