《食品和化妆品中抗氧化功效的测定 体外角质细胞SOD酶活法》

ICS67.050

CCSX04

团体标准

T/GDFCA0XX—202X

食品和化妆品中抗氧化功效的测定体外

角质细胞SOD酶活法

Determinationofantioxidantactivityinfoodsandcosmetics--Invitrokeratinocyte

SODenzymeactivitymethod

2022-xx-xx发布2022-xx-xx实施

广东省食品流通协会发布

T/GDFCA0XX—202X

食品和化妆品中抗氧化功效的测定体外角质细胞SOD酶活性法

1范围

本文件规定了角质细胞分泌物SOD活性测定试验的基本技术要求。

本文件提供了一种经由角质细胞分泌物SOD活性的检测方法，可作为化妆品、食品原料关于抗氧化

功效称谓的证据支持之一。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

SN/T3899—2014化妆品体外替代试验良好细胞培养和样品制备规范。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

人永生化角质细胞HaCaT

该细胞来源于正常成年人的皮肤组织，是在体外培养后自然转化的永生化的人角质细胞。角质细胞

是构成人体表皮的主体细胞，体内呈分层生长排列，可用于人表皮细胞角化的研究。

超氧化物歧化酶Superoxidedismutase，SOD

超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶，可在角质细胞、肝脏组织等胞内生产，它可以催

化超氧阴离子(O2-)的歧化反应，生成过氧化氢和单质氧。

4原理

生物体内的自由基已成为研究的热点，超氧化物歧化酶(SOD)作为天然的抗氧化酶，可在细胞内

生成。在测定SOD活性时，SOD能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，所以基于NBT或WST的显色反应可以

被SOD所抑制，因此SOD的活性与甲臜染料的生成量成负相关，从而通过对显色产物的比色分析即可计算

SOD的酶活力。通过比较阴性对照与受试物给药组的显色底物的吸光值，可计算SOD酶活上调率。

5试剂

除非另有规定，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。与细胞培养相关试剂、耗材

应作无菌处理。

细胞培养涉及试剂及耗材

胰蛋白酶/EDTA溶液（0.25%胰酶溶液与0.02mol/LEDTA溶液1:1混匀），磷酸盐缓冲液（PBS），

细胞培养瓶，青霉素-链霉素，DMEM培养基（含2mML-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖）或其他经验证合适的

培养基，完全培养基需添加10%新生牛血清。

检测涉及试剂及耗材

Western及IP细胞裂解液(CelllysisbufferforWesternandIP)：一种在非变性条件下裂解细

胞或组织样品从而制备蛋白样品的裂解液，苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）：

蛋白酶抑制剂，超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒，阳性物质：表儿茶素CAS490-46-0，制备高浓度样

品溶液：二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、无水乙醇、灭菌超纯水。

6材料

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微孔滤膜：0.22μm。

细胞培养板（规格24、12孔、6孔均可）。

细胞培养瓶。

无菌旋盖离心管（15和50mL），无菌离心管（1.5和2.0mL）。

7仪器和设备

天平：感量为0.1mg

生物安全柜：生物II级

恒温水浴锅

二氧化碳培养箱：37℃，5%CO2。

pH计：精度±0.1。

低温离心机

涡旋振荡器

微孔板酶标仪或分光光度计，配置450nm或560nm滤光片

高压灭菌器

无菌微量移液器：1-10µL；20-200µL；100-1000µL

倒置显微镜

8试样的制备

受试物准备

8.1.1除非有稳定性数据证明储备液可接受，否则受试物必须在使用前新鲜配置直接使用。

8.1.2水中溶解度受限的受试物应当溶解在适当的溶剂中，溶剂体积应在所有培养物中保持一致，并

且无细胞毒性。

8.1.3受试物浓度的选择应避免出现沉淀和溶液呈现云雾状。

8.1.4宜使用二甲基亚砜（DMSO）和无水乙醇为溶剂，其他低细胞毒性的溶剂也可使用。

8.1.5在使用溶剂前，应仔细评估它们的特殊性质，例如：是否与受试物发生反应，或溶液中的化学

稳定性。

8.1.6可使用涡旋混合/或超声处理和/或加热到适当温度等方法辅助溶解，除非这些操作会影响到受

试物的稳定性。

样品配制

8.2.1在无菌条件中，使用1.5mL或2.0mL无菌离心管完成样品母液制备（制备量应大于1.5mL），

使用0.22μm无菌滤膜过滤。

8.2.2受试物浓度应通过细胞毒性检测确定受试物的浓度范围。例如选择细胞活力≥90%，且细胞形

态与对照组无明显差异的浓度。

9阳性对照

每一次试验都应同时使用阳性对照进行试验。推荐阳性对照物，如250μg/mL表儿茶素，具体

的给药浓度可根据各试验室培养细胞特性进行调整；

据历史资料，试验可接受标准为：SOD酶活性上调率≥20%。

10检测步骤

细胞消化、接种

10.1.1采用胰蛋白酶/EDTA，具体消化浓度及用量需根据实验室细胞特性确定：宜胰酶浓度为0.25%，

T25培养瓶胰酶用量1mL，T75培养瓶胰酶用量3mL。

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10.1.2倒置显微镜下观察，至大部分细胞变圆并处于悬浮状态时，加入体积为胰酶体积2～3倍的含

血清的DMEM培养基终止消化，并收集至离心管中，800r/min离心6min。离心结束后，弃掉上清

液，向离心管中加入一定体积的细胞培养基，弯头吸管吹打混匀细胞，细胞计数仪或血球计数板进行计

数。

接种铺板

10.2.1用细胞培养基稀释细胞至接种密度，接种至孔板中，孔板的规格可根据试验需求进行调整，12

孔、24孔板及6孔板均可。

10.2.26孔板加液量为2mL，12孔板、24孔板加液量为1mL，细胞浓度为2×105cell/mL。

10.2.3接种结束后，放置于CO2培养箱中培养24h±2h。

给药

铺板24h±2h后，细胞与底部融合率达到60-80%可开展给药操作。弃掉孔板各孔中的培养基，

开展给药操作。受试物孔中加入一定浓度受试物的培养基，阴性对照、空白对照和裸细胞孔中加入正

常培养基，阳性对照加入含有相应浓度阳性对照的培养基，阳性孔加入含250μg/mL表儿茶素的培养

基。

每孔加液量视孔板规格而定，宜6孔板加液量为2mL，12孔板，24孔板加液量为1mL。且试

验平行n≥3；

制备样品溶液

给药处理24或48h后，吸出液体，使用PBS洗净细胞。孵育时间可根据试验室细胞特性进行调

整。

使用含有1mM的PMSF的裂解液进行裂解细胞，宜6孔板加液量为200μL，12孔板，24孔板

加液量为100μL。处理1-2s后抽打混匀，转移到离心管中。

在0-5℃下，在10,000×g离心15min，将上清液移入新的试管中，制成样品溶液。

SOD酶活力检测

10.5.1SOD检测需要根据总SOD检测试剂盒的操作说明书进行检测。如选用WST-1或WST-8法，

则检测仪器需要配备450nm滤光片；如选用NBT法，则检测仪器需要配备560nm滤光片。

10.5.2在正式检测前，应设定稀释比例，进行预实验，摸索确定样品的稀释比例，以保证检测数值落

在检测范围内。

11计算

SOD酶活性上调率的计算公式

C

SOD酶活性上调率=（1）100%

C0

式中：

C—受试物组的酶活力；

C0—空白组的酶活力。

12试验有效性验证

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12.1.1试验系统有效性判定：每批次试验应设置阴性对照及阳性对照，阳性对照组中SOD酶活性上

调率≥20%，则认为试验系统有效。

12.1.2平行性判定：统计酶标仪测得的各组平行孔间吸光度的标准差（StandardDeviation，SD），

并计算变异系数（CoefficientofVariation，C.V），C.V值≤20%，则认为试验平行性有效。

13结果报告

上调率

上调率表示为平均值（mean）±标准差（SD）。结果保留至小数点后两位。

显著性

评价受试物影响SOD酶活性提高，需要受试物的上调率数值为正数，且与阴性对照的结果具有显

著性差异（P<0.05）。

表述