目前糖生物学研究方法

目前糖生物学研究方法一．研究对象糖生物学(glycobiology)是研究聚糖及其衍生物的结构,化学,生物合成及生物功能的科学蛋白质、核酸和多糖是构成生命的三类大分子，蛋白质和核酸的研究已经是生命科学中的点问题。糖类的研究一度被人遗忘，只有少数科学家在苦苦探索着糖类的奥秘，糖类研究成了生命科学中的灰姑娘。然而，随着蛋白质和核酸（主要是基因的研究）中更多的奥秘被人类知晓，糖类的重要性也浮出水面，成为了医学研究的“甜蜜之点”，糖类研究这个“灰姑娘”等来了属于她自己的马车。科学家认为，糖类的研究将像一个人见人爱的“甜苹果”一样，获得更多科学家的青睐，将成为生命科学研究中的新热点。二．糖生物学的起源\o"编辑本段"科学家把研究生物体内多糖的科学叫做“糖生物学”，也有人沿袭“基因组学”和“蛋白质组学”的概念把这们学科叫做“糖原组学”。随着糖生物学基础研究的发展，用于糖生物学研究的方法和基本技术，以及把基础研究所得的成果进一步转化为生产技术等方面的研究也倍受重视，“糖工程学”的兴起也是极为自然的了。

各国政府对糖生物学研究的支持

1989年日本创刊了《糖科学与糖工程动态》(TIGG)杂志。同年日本政府科学技术厅提出关于“糖工程基础与应用研究推进战略”的咨询，经过专家评议后成为详尽的战略方案，于1991年由科学技术厅、厚生省、农林水产省和通商产业省联合实施“糖工程前沿计划”，总投资百亿日元。该计划包括：糖工程和糖生物学。后者又分为糖分子生物学、糖细胞生物学。同时，成立了“糖工程研究协议会”作为协调机构。这协议会编辑出版了专著《糖工程学》。

美国能源部于1986年资助佐治亚大学创建了复合糖类研究中心(CCRC)，建立复合糖类数据库(CCSD)，相关的计算机计划也称为糖库计划(Carbank

Project)。1990年底已收集了6000个糖结构数据，1992年增加到9200个(包含在20000份记录中)，1992年底有关的记录增加到22000份，1996年增加到42000份。1996年一年中增加的数量为1991年的4倍。欧洲也不甘落后。欧盟1994～1998年的研究计划中有一项“欧洲糖类研究开发网络”计划(European

Carbohydrate

Plaform)。其目的是携带欧洲各国的糖类研究和开发，以强化欧洲在糖类基础研究以及将研究成果转化为商品方面与美国、日本的竞争能力。由于美、日、欧三方的重视。近年来在糖类研究方面已取得不少进展。研究结果已确证，糖类作为信息分子在受精、发生、发育、分化，神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起着重要作用；炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增殖和转换、病原体感染、植物和病原体相互作用、植物与根瘤菌共生等生理和病理过程都有糖类的介导。在此基础上，新兴的糖生物学正处在蓬勃发展的起点。糖生物学涉及到许多生物学科，如分子生物学、细胞生物学、病理学、免疫学、神经生物学等。糖生物学研究的发展又推动了这些学科的快速前进。21世纪生命科学的研究焦点是对多细胞生物的高层次生命现象的解释，因此，对生物体内细胞识别和调控过程的信息分子——糖类的研究是必不可缺的。三.糖生物学的崛起最近美国每隔二年召开一次“糖工程”会议。在1993年首届“糖工程”会议上，著名的糖生物学家、会议的主持人Hart说，生物化学中最后一个重大的前沿，糖生物学的时代正在加速来临。在第2届会议时，又说，糖生物学是生物化学和生物医学交叉点的前沿。1996年在米兰召开的第18届国际糖化学讨论会上，vonBoeckel等报告合成了肝素中抗凝活性碎片——五糖的模拟物，其活性是天然产物的2倍，因此，他获得了以糖化学先驱Whistler命名的奖项。自1991年《结构生物学当代见解》杂志(CurrentOpiniononStructureBiology)创刊以来，每年的第5期上都有“糖类和糖复合物”为题的专辑。1995年的主编Feizi为专辑加了个副标题“寡糖配体和糖结构数据库的时代已经来临”。这预示了一个新的转变：前几年是以选凝素和细胞粘附分子等糖结合蛋白为主角；而今则是这些蛋白质的配体寡糖链粉墨登场，真正的糖类分子将在舞台上扮演主角。1997年在苏黎士召开的第14届糖复合物国际年会上，Hart因他的发现而获奖，就他们的发现作了专题报告。报告的内容以综述的形式登载于1997年的《生化年评》上。他和同工作者发现了在细胞质和核内特有的O-GlcNAc糖基化。这种糖基化仅在核质内的蛋白质上接上单个O-GlcNAc，但可以发生这种修饰的蛋白质非常广泛，包括核孔蛋白、RNA聚合酶、转录因子、染色体蛋白。而且这种糖基化是可逆的动态调节，可以和磷酸化发生置换。这些结果均提示，O-GlcNAc糖基化具有和蛋白质磷酸化相似的生物学意义。在第14届糖复合物年会上，还出现了“免疫糖生物学”、“神经糖生物学”和“植物糖生物学”等新的分支学科，新的前沿领域。1998年5月于德国召开“国际糖生物工程讨论会”。这次讨论会下设3个分支：(1)糖生物学，包括糖蛋白和糖脂合成的分子生物学、糖基转移酶的分子生物学、细胞内的通路和投送受体、分化发育和基因治疗、免疫学和神经生物学、寄主和病原体的相互作用、糖基化和疾病；(2)糖化学，涉及的内容有化学合成、组合合成、酶法合成、分子相互作用和结构分析、数据库和网络；(3)糖生物工程，有关的方面为：发展糖药物的重组工具、表达系统、宿主和载体、宿主细胞的糖基化工程、糖蛋白生产系统、生物工程工序、药理学和诊断、重组和天然糖蛋白的糖信号及其在体内的命运和靶向性、质控和分子技术、法规条例。一些发展中国家也给予糖生物学以一定的重视，并竞相主办国际性会议。1997年在爱尔兰的Galway曾召开过皇家化学学会糖类春季讨论会，并计划在1999年召开第10届欧洲糖讨论会。1997年在波兰华沙召开了鞘糖脂和鞘氨醇的结构、代谢和功能的国际讨论会。1999年1月印度在Bangalore主办第5届国际真核细胞表面生物大分子生物功能讨论会。四．糖生物学的研究对象及方法（1）多糖的提取方法：中性盐溶液提取法、水解酶消化提取法、蛋白酶水解法。（2）多糖的分离纯化：目前，有关寡糖分离纯化的方法有很多，有活性炭柱色谱法，纤维柱色谱法，硅胶柱色谱法，葡聚糖凝胶色谱法，阴离子交换色谱法以及高效液相色谱法等。其中高效液相色谱法作为重要的分离技术，具有分离效率高，分析速度快的和适用范围广等特点，被认为是迄今为止人类掌握的对复杂混合物分离能力最佳的手段之一。用于糖类物质分离的高效液相色谱法主要有以下几种分离模式。2-1阴离子交换色谱法阴离子交换色谱法的原理是：糖分子的pKa值通常在12—14之间，呈弱酸性，再强碱性流动相中会部分或全部以阴离子形式存在，能在阴离子交换柱上被保留并得到分离；分离后的糖链可直接进入脉冲安培检测器被检测。这种糖类物质无须衍生化和复杂的样品处理过程，具有快速，微量，高效，选择性好，灵敏度高等特点，是分析中性或酸性糖链混合物良好的工具。目前已经广泛应运于生化，医药卫生，食品，饮料等样品中单糖，二糖，低寡聚糖，糖醇和氨基糖等的分析。但该法存在的缺点用强碱性溶液作为洗脱剂的缺点是用强碱性溶液作为洗脱液会引起糖链的差相异构和降解；同时分离后的糖链含有大量的无机盐，而系统又没有脱盐步骤。因此用该方法得到的样品不能直接用于后续的质谱分析。亲水作用色谱亲水作用色谱是一种以强亲水性的极性吸附剂作为固定相，以高比例有机相／低比例水相缓冲液作为流动相，用来分离极性和亲水性化合物的液相色谱模式。是反相液相色谱的重要补充。在亲水作用色谱中，流动相中的水是强的洗脱剂，乙腈或异丙醇往往被作为弱洗脱剂；固定相常使用硅胶，氨基，等正相色谱填料或者特殊设计的表面含有极性基团的亲水作用色谱专用填料如酰胺基，聚琥珀酰亚胺及其衍生物等。亲水作用色谱在糖链分析中具有最好的选择性，是寡糖分离的理想色谱模式。多孔石墨化碳色谱小粒径的多孔石墨化碳由六方形排列，共价结合的碳原子层构成，层与层之间由范德华力联系，表面结构均匀，稳定性好，可耐受的pH范围为1—14.与传统的反相色谱填料相比，石墨化碳表面具有奇特的极性增强效应以及在某些条件下较强的疏水性，因此被用于极性很强的物质分析。与阴离子交换柱分离原理不同的是：多孔石墨化碳色谱柱的保留机制不仅基于填充剂与样品间的疏水作用，而且还包括电子受体-供体之间的诱导电荷偶极作用力具有较大的色谱柱容量，小粒径的多孔石墨化碳与糖链之间的极性相互作用对糖链的保留较强，大大提高了糖链分离的选择性，非常适合于寡糖的制备性操作。而且洗脱时只要用易于除去的水溶性有机溶剂即可。由于糖的亲水性强，常规的反相高效液相色谱柱分离时需要进行衍生化，操作复杂；而小粒径的多孔石墨化碳柱对非衍生化的寡糖和带有少量氨基酸残基的糖肽都能获得良好的分离效果，而且特别对唾液酸化糖链的分离具有很好的选择性。因此可用于糖链异构体和唾液酸化糖链的分析。但由于该法的重见性和稳定性相对较差，在一定程度上限制了其成为糖链分离的常规方法。2—4柱前衍生-反相高效液相色谱：该法对糖链的衍生化有还原端的衍生化和非还原端的衍生化。反相高校液相色谱是高效液相色谱中最常用的分离模式，然而天然糖类物质却因极性较大，难以直接在常规的反相柱上实现分离。加之尽管上述高效液相色谱的多模式分离能力能够实现复杂化合物糖链的分离纯化，但因糖类物质缺乏明显的光学活性基团，无法满足柱后高灵敏度光学检测的需要，使分离后糖链的后续检测成为困难。尽管安培，示差，蒸发光散射等检测器可以实现对糖类的检测，但在仪器的兼容性，检测灵敏度以及糖链收回等方面换不能满足要求。为了解决这一矛盾，糖链的柱前衍生化起到了至关重要的作用。在糖链进入色谱柱分离之前先将其与具有紫外或荧光活性的物质进行标记，使糖链带上荧光或荧光基团，满足光学检测的要求；由于用于标记的紫外或荧光物质一般具有较强的疏水性，因而衍生物很容易在常规的反相色谱柱上保留，实现分离。五、多糖分析与结构鉴定无论对多糖，寡糖还是糖蛋白上的糖链分子，对其进行分析与鉴定都是很困难的工作，这方面技术手段的欠缺也在很长时间内影响了糖生物学与糖生物工程的发展，是其远远落后与核酸与蛋白工程的原因。但随着生物化学，分析化学等科学的发展，现在，解析糖的结构已经不在是令人望而生畏的工作，通过多种技术手段的整合，即使针对复杂的混合样品，也可以完成结构鉴定工作。以下是多种糖分析技术及基于质谱的糖结构鉴定技术。3—1糖分析技术（1样品的前处理前处理是进行糖结构研究的必须手段，用于糖结构研究样品的前处理方法主要有水溶液提取，亲脂性有机溶剂的提取，从而得到水溶性，脂溶性和不溶性的三大类型的分子。水溶的部分所包含的含糖类物质最多，其中有糖蛋白，蛋白聚糖，简单的多糖，以及多种多样的小分子糖苷类物质等。脂溶的部分中主要的含糖组分是糖脂和一些小分子糖苷。而水溶性和脂溶性的部分，如果依据分子量，它们又可分为几个级分。水溶性如果可以分为大，中，小三个很粗的级分外；而脂溶性部分一般仅中和小三个级分，因为一般的糖脂分子量都不是很大的。糖组在某种意义上也可以归属为代谢物组，因此，水溶性和脂溶性的小分子更多的作为代谢物组的研究对象。（2色谱高效液相色谱是目前广泛使用的技术，因此，分析一个糖组是最常用的方法莫过于高效液相色谱，对糖链鉴定的二维高效液相色谱图谱法已经普遍使用。可是，传统的二维高效液相色谱图谱法鉴定的样品是纯的糖链，按照该方法的常规操作，是对纯的糖链进行荧光标记，并经过两种不同的色谱柱，分别得到两个出峰时间，由出峰时间确定样品的结构。而糖组研究的是一个组织，细胞和体液中的所有N—糖链样品，虽然经无水肼处理，可以很方便地得到一组由样品中糖蛋白上降解下来的N—糖链，但是无法使用金典的高效液相色谱图谱法。如果使用串联的多维色谱可以解决这样的问题。（3电泳（3.1如果不是用于样品制备，电泳在糖组分析上和色谱一样，是非常有用的工具。一些糖蛋白简单的糖型，可以用毛细管电泳加以鉴定。除此之外，还有利用高效毛细管电泳在两种不同的缓冲系统中，测定多种N—糖链的迁移率，并且也制作了和二维高效液相色谱图一样的二维毛细管电泳图谱。同样，二维毛细管电泳图谱可以对一些纯的糖链样品的结构进行鉴定。除非利用串联的毛细管电泳，否则一般的毛细管电泳在糖组研究中，不能达到高通量，快速分离的目的。（3．2、荧光辅助糖电泳原理和核酸的凝胶电泳的原理相似，除去了N—糖链和O—糖链外侧的唾液酸后，这些糖链基本上是中性的，如果利用带有氨基的酸性染料，与糖链还原端的醛基反应，就可以使糖链带有荧光的同时，也具有强的酸性。但该法也有一定的缺点，通常只能知道个组分的大小，，而不能知道关于糖链的更多信息。（3.3二维凝胶电泳以等电点聚焦和SDS—凝胶电泳相结合的二维凝胶电泳，虽然不能检测完整的糖组，但是在研究糖蛋白组时，仍是很有用的，在常规染色后得到的二维凝胶电泳图谱中，如果发现一串分子量相近的电泳行为不同的显色斑点，这就提示了这些斑点很有可能是一组肽链结构相同或相似的蛋白质经修饰后产生的复合性蛋白质。在诸多的复合蛋白质中，最常见的又是糖蛋白。因此，对这样的一组显色斑点的深入极有可能提供有关糖蛋白组的信息。如果在得到了二维凝胶电泳图谱后，不是使用常规的考马斯亮兰进行染色，而是利用特异的用荧光标记的凝集素进行类似与传统的组织化学染色的过程，则可以得到更多的信息。凡是能被凝集素先显色的斑点都是糖蛋白，再根据不同凝集素染色的结果，可以推测不同的斑点可能含有的糖链结构。根据这些结果，可以有目的地对二维凝胶电泳图谱中的斑点进行后续的糖蛋白组的研究。(3.4亲和色谱亲和色谱在糖类研究中占有重要的地位，以为在自然界中存在着一大类被称为凝集素的糖类结合蛋白。凝集素和糖类的相互作用，犹如抗体与抗原的作用。因此，在糖类的分离和纯化，以及研究糖类和糖缀合物中糖部分的结构与功能时凝集素是经常使用的工具。早年在分离和鉴定糖蛋白和糖链时，曾使用了系列亲和色谱技术。其基本原理是，在自然界中存在着各种各样的凝集素，它们有各自不同的糖结合专一性，因此，分别将糖类专一性不同的几种凝集素固定化，然后，