国家自然科学基金讲座

新形势下国家自然科学

基金申报的方法与策略

2012.10.31新形势国家层面资助额度和年限的变化各领域研究热点的变化指南内容二审中评委人员的变化学校层面数量和比例的变化一、国家自然科学基金资助体系三大体系：项目资助体系人才培养资助体系环境条件项目体系国家自然科学基金资助格局项目资助体系人才培养体系面上项目重点项目重大项目重大研究计划国际合作与交流国家杰出青年科学基金海外及港澳学者合作研究基金创新研究群体科学基金国家基础科学人才培养基金青年科学基金\地区基金专项项目联合资助定位：面上项目：全面均衡布局，瞄准科学前沿，促进学科发展，激励原始创新；青年基金：“起步基金”，培育后继人才，扶持独立研究，激励创新思维；重点项目：指南引导优先领域，瞄准国际前沿整合创新资源，孕育重点突破；重大项目：面向国家重大需求，选择关键科学问题，汇聚力量多学科交叉；杰出青年科学基金、科学仪器基础研究专款、重大国际(地区)合作研究项目等。

对基础研究和应用基础研究项目的资助主要资助类型：面上项目:

包括一般面上项目和青年基金项目自由探索，自由选题重点项目：学科前沿、新生长点；重要意义重大项目：重大科学问题杰出青年基金项目：45岁以下地区科学基金项目二、选题强调新颖、有特色关键是创新，国内第一无优势最好选择研究领域的主流方向有学科前沿研究内容的潜在内涵要有具体的切入点，避免“大、空、泛”要注重科学意义与学术价值要凝练申请项目的文字表述，要力争用最少的文字，简单易懂，让评审者能迅速体会到项目的创新性和科学意义评价标书好坏的首要条件是选题：选题不好，即使修改也不会中标除上面提到的选题标准之外，针对医学工作者，好的选题应该是：（1）从临床实际工作中提炼“申报的题目”，充分利用临床病例，在此基础上，再应用模式材料—细胞、实验动物拔高，或在基础研究中发现的新现象，一定要与临床病人相联系；（2）要符合国际研究新动向（新理论、新技术）；（3）要考虑其科学意义和潜在的实际应用价值—是否有潜在的用途或揭示新的致病机制

选题一定要有自己的工作基础（自然基金特别强调具有自主知识产权的工作基础），一般要提前半年或一年选题，一旦选定后，注意工作积累，补充支持选题的实验数据。三、如何撰写申请书(一)摘要(限400字)

包括：研究方法、内容、目标、科学意义等。一般撰写格式：如：“用……方法（手段）进行……研究，探索/证明……问题，对阐明……机制／揭示……规律有重要意义，为……奠定基础／提供……思路”或以前期工作中发现的一个新现象开头，描述本项目将从哪些方面探索隐藏在该现象之后的机制和规律，并说明阐明之后的科学意义。可以是最先撰写或最后撰写采用分子生物学、组织学、电生理学及放射性示踪等方法，研究低频超声选择性开放血肿瘤屏障的作用效果，分析在血肿瘤屏障开放过程中参与血管内皮细胞紧密连接开放和胞吞转运相关蛋白的变化，揭示低频超声开放血肿瘤屏障的作用机制。在此基础上，结合缓激肽对血脑屏障的选择性开放作用，研究低频超声及低频超声与缓激肽协同作用对治疗胶质瘤的化疗药物卡铂的转运效果，以及对脑胶质瘤大鼠生存时间的影响。本研究项目不仅能够揭示低频超声开放血肿瘤屏障的作用机制，而且能为选择性开放血肿瘤屏障和血脑屏障，治疗脑胶质瘤等神经系统疾病提供新途径。(二)、项目组组成成员结构合理：6-10名，其中高级1-2名、中级2-3名、技术人员1-2名、研究生不少于2名

青年科学基金：应以青年人为主副高职以上人员不能在两个以上的面上项目中出现（可以是两个）备注：副高职以上人员出现的最多次数3次，但其中1项只能为重点或重大项目，注意基金委的要求在变化(三)、经费申请实验材料费：60-70%

人员费：（劳务费）5%

管理费：5%

仪器费：不填，要填则小于10%；不要购置5万元以上仪器设备合作费/协作费：小于10%其他经费资助（含部门匹配）：不填整体经费要恰当，过多和过少都对中标无益(四)、立论依据这部分内容是整个标书的核心，一般评审标书人员都是根据立题依据而做出判断是否资助（同时结合工作基础）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目科学意义。对应用基础研究，着重结合学科前沿，围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题论述其应用前景。立题依据在写法上应分段，一段说明一个问题。在研究领域（疾病诊防治）层面从研究方向展开围绕本项目拟解决的问题进行归纳分析提出设想从研究领域（疾病诊防治）切入研究意义立论依据1、项目的研究意义撰写方法：从疾病入手，简述其特点、危害，目前主要的治疗方法及其存在的问题。

简要分析该病发病机理和主要研究热点，引出目前存在的主要问题，也就是本项目要解决的问题，以此为切入点提出假设，阐述如果实现预期目标，对该病甚至相关疾病的预防、治疗具有的理论意义和临床价值。

在脑胶质瘤组织中，尽管肿瘤细胞破坏了部分血脑屏障(BBB)的正常结构，但血液与脑肿瘤组织之间仍然存在着屏障，即主要由脑肿瘤毛细血管内皮细胞形成的血肿瘤屏障(BTB)，显著限制了治疗性药物向肿瘤组织中的转运。在过去的10年中，为了将治疗药物选择性转运至脑肿瘤组织，科学家们进行了大量的努力，例如，通过化学方法使药物脂溶性增加，使用载体协助穿越血肿瘤屏障，颈动脉内注射高渗溶液或其它能够增加血肿瘤屏障通透性的药物。然而这些在实验阶段均显示良好疗效的方法，因其选择性开放血脑屏障的程度不一，在临床前期实验中均显示出了治疗的局限性，限制了它们的应用。因此，如果能寻找到有效、高选择性开放血脑屏障的方法，将能为脑肿瘤患者的临床化疗提供一个新的低损伤、高效能的治疗方案。2、国内外现状分析（不等于综述）特别要指出尚存在的或未解决的问题(可以是1~3段)存在问题：

文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解，提出的问题别人已解决---低水平重复。对研究方法不熟悉，简单移植或夸大其作用，缺乏实际应用的可行性---无法实现预期目标。

---已有方法与掌握方法的人的结合；

---方法理论上可行与现实可行性的结合。对国内外现状缺乏归纳分析，只是简单罗列，缺乏逻辑性和针对性---总结与表达不够。3、描述工作基础

描述自己的前期工作结果，并说明这些工作结果与解决目前国内外尚未解决的问题的关系(提出工作假说/假设)；特别关键性的工作结果可以在文字后附上1-2个图(最好是图片，其他工作结果可附在后续工作基础中，并注明)。4、说明本课题究竟去做什么，解决什么问题，这些问题的解决究竟有何科学意义和应用价值/前景（最好能与在国内外研究进展一段中所指出的尚未解决或存在的问题有关联）

我们在已结题的国家自然科学基金（No.)中，构建了多基因重组单纯疱疹病毒，研究了脑胶质瘤的基因治疗，结果发现应用缓激肽选择性开放大鼠血肿瘤屏障后，灌注重组单纯疱疹病毒引起的肿瘤治疗效果显著优于肿瘤内局部注射重组单纯疱疹病毒的效果。但是缓激肽选择性开放血脑屏障持续时间短，应用此方法进行目前以静脉滴注为主的化疗药物等的药物转运时，因血脑屏障开放时间的限制，难以达到有效提高肿瘤组织中药物浓度的目的。

为了能够达到临床应用的目的，必须找到持续时间长、高选择性开放血脑屏障的方法，结合脑胶质瘤术后存在减压骨窗的特点，我们尝试了采用低频超声辐照选择性开放血脑屏障的方法。预先给予大鼠造影剂Optison后用低频超声辐照脑组织，结果发现辐照部位的血脑屏障出现了可逆性开放，且辐照部位没有红细胞渗出等损伤。血脑屏障在低频辐照后30分钟显著开放，开放的持续时间为5小时，5小时后血脑屏障逐渐关闭。

应用超声调节血脑屏障通透性报道极少。高频超声能造成血脑屏障结构的破坏。关于低频超声辐照开放血脑屏障方面的研究在国内未见报道，国外研究也刚刚开始。令我们感到十分紧迫的是，最近，美国有人报道了用超声手段选择性开放血脑屏障的探索研究，这篇报道是应用超声开放了家兔的血脑屏障，但是采用的超声频率和其它技术条件以及动物模型与我们的都不同。结合我们的工作和国外的文献报道，说明用超声手段选择性开放血脑屏障是一个有很大研究价值的新课题。应用超声开放血脑屏障的机制不清。近日，我们培养了大鼠脑微血管内皮细胞(附图)，建立了体外血脑屏障模型；采用免疫荧光法检测发现，低频超声辐照后的体外血脑屏障模型上的微血管内皮细胞的紧密连接相关蛋白Claudin-5呈不连续状态分布，提示紧密连接开放(附图)；透射电镜扫描观察到，正常大鼠辐照后30分钟脑毛细血管内皮细胞间的紧密连接开放(附图)。这些结果提示，低频超声辐照引起的血脑屏障开放可能与内皮细胞间的紧密连接开放有关。

应用低频超声选择性开放血脑屏障主要可能由超声波和造影剂对脑毛细血管内皮细胞造成的物理学上的和生化学上的反应所致。例如，低频超声波可能导致造影剂在毛细血管内膨胀和收缩，膨胀充满整个毛细血管管腔，可能导致血管壁机械性拉长。我们推测这种拉长作用可能导致紧密连接的开放。同时，毛细血管内压力的变化也可诱发生化反应，引起血脑屏障的开放，而且血压的增加和改变也影响血脑屏障。造影剂的降解，可能引起一系列反应开放血脑屏障。无论物理学的还是生化学的反应，选择性开放血脑屏障的最终作用点是脑毛细血管内皮细胞。

结合国外研究进展和我们长期的关于选择性开放血脑屏障机制方面的研究，我们认为应用低频超声选择性开放血脑屏障的机制可能为：1.内皮细胞的胞吞转运作用增强；2.内皮细胞间的紧密连接部分开放；3.某些通道开放。本研究将主要集中在内皮细胞的胞吞转运作用和内皮细胞间紧密连接的结构和功能变化上，以探索寻找出选择性开放血脑屏障的新靶点。

本项目首先要研究低频超声辐照选择性开放血脑屏障的机制；进一步把这种方法用于脑胶质瘤的化疗研究(胶质瘤术后的骨窗更是应用低频超声进而开放血脑屏障的理想部位)，验证低频超声辐照是否能够选择性开放血肿瘤屏障，用这种方法转运化疗药物进入胶质瘤组织中，观察其疗效，同时研究低频超声辐照选择性开放血肿瘤屏障的机制；

第三，由于缓激肽可以选择性地开放血脑屏障，本研究将研究低频超声辐照和缓激肽协同作用对选择性开放血肿瘤屏障的作用效果。期望达到高选择性、持续时间长地开放血肿瘤屏障，更易于转运化疗药物的目的。本研究不仅能为脑肿瘤患者的临床化疗提供一个新的低损伤、高效能的治疗方案，也能为其它神经系统疾病的药物治疗提供新途径。5、参考文献要写全作者，应包含年限新的文献（也最好引用自己的重要文献），参考文献以20篇左右为宜

A、要以英文文献为主，同时也要引用国内同行知名专家的文献。

B、引言信息要全：文章题目、作者姓名、具体出处（包括期刊名、年份、卷期、页码等）。

C、主要引用近五年的文献，最好能有申请当年的最新文献。(五)项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题1、研究目标要与研究内容有区分，应写出本课题完成之后所达到的目的和能解决的科学问题撰写要求：有限目标，与研究内容相呼应，3条左右。

如：探索……问题，明确……关系，揭示……规律，阐明……原理（机制），建立……方法等。研究目标：(1)研究低频超声辐照在选择性开放血肿瘤屏障中的作用，探讨低频超声辐照开放血脑屏障和血肿瘤屏障的作用机制。(2)研究低频超声辐照对治疗胶质瘤的化疗药物卡铂的转运效果的影响，以及对脑胶质瘤大鼠生存时间的影响。(3)探索低频超声辐照和缓激肽的协同作用对血肿瘤屏障开放效果的影响，对脑胶质瘤大鼠生存时间的影响，为临床应用提供实验依据。2、研究内容：为目标服务，说明为完成目标，去做什么；撰写的一般模式：应该逐条写出所要解决的具体科学问题，如：1……;2……;3……;4……。在每一个科学问题之后，可以适当有使读者能看懂的必要说明、技术思路（也可包括关键动物及技术）；内容要适当，能确保在研究周期内完成，面上项目一般为5-7个具体内容。存在问题：

内容过多，一个研究周期难以完成；内容分散，不能集中阐明研究目标。撰写要求：内容要适当，确保研究周期内完成；与目标相辅相成，为研究目标服务；篇幅要适度，注意与技术路线区别。研究内容：（1）建立C6脑胶质瘤大鼠模型和体外血肿瘤屏障模型。（2）研究低频超声辐照选择性开放血脑屏障和血肿瘤屏障的效果和机制：观察低频超声对体内和体外血脑屏障和血肿瘤屏障超微结构和通透性的影响，分析紧密连接相关蛋白和质膜微囊结构蛋白的分布和表达变化。（3）研究低频超声辐照对治疗胶质瘤化疗药物卡铂的转运效果的影响，以及对脑肿瘤大鼠生存时间的影响。（4）研究低频超声和缓激肽的协同作用对血肿瘤屏障的开放效果的影响：观察低频超声和缓激肽联合应用对血肿瘤屏障超微结构和通透性的影响，紧密连接相关蛋白和质膜微囊结构蛋白的分布和表达变化；同时观察二者联合应用对化疗药物的转运效果和对脑肿瘤大鼠生存时间的影响。3、拟解决的关键问题：关键问题主要是指在课题研究过程中的关键点(瓶颈问题)，关键点解决了，虽然不代表课题全部完成，但能透视出课题顺利完成的前景。研究过程中对达到预期目标有重要影响的某些研究内容或因素；为达到预期目标所必须解决的关键技术和研究手段。关键问题要突出，且有一定难度。一般撰写模式：包括两个内容或两大句话，一是理论问题（某个研究内容，要变着法说）；二是关键的技术问题。4、研究方法

存在问题：

过于简单：在实验方案中只有方法名称而无具体步骤。

过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。

撰写要求：以研究项目的需求为前提，尽量采用目前最先进的方法和手段，并将其操作步骤和关键环节体现在技术路线当中。5、技术路线

以研究内容为主线，首先画出一个技术路线(也就是研究思路与关键技术)流程图；然后围绕前面提出的研究内容，逐条详细写出完成各项内容的主要实验步骤(研究方法溶在其中)

存在问题：不清楚，不详细，不可行。

撰写要求：清晰、详细、注意逻辑性。

撰写方法：以时间顺序为主线设计技术路线以研究内容为主线设计技术路线分大小标题，突出逻辑关系。详细地写清楚每个具体步骤。细胞水平实验部分：

体外血脑屏障模型和血肿瘤屏障模型的建立低频超声辐照测定低频超声辐照后不同时间点的TEER值透射电镜观察不同时间点紧密连接相关蛋白和质膜微囊蛋白的分布及其超微结构改变免疫荧光法检测不同时间点紧密连接相关蛋白ZO-1,Claudin-5,Occludin和质膜微囊蛋白Caveolin-1,Caveolin-2的分布变化研究不同时间点TEER值与紧密连接、胞吞转运之间的相关关系，明确低频超声选择性开放血脑屏障和血肿瘤屏障的作用机制。RT-PCR法测定不同时间点紧密连接相关蛋白ZO-1,Claudin-5,Occludin和质膜微囊蛋白Caveolin-1,Caveolin-2的mRNA表达水平变化Westernblot法测定不同时间点紧密连接相关蛋白ZO-1,Claudin-5,Occludin和质膜微囊蛋白Caveolin-1,Caveolin-2蛋白表达水平变化(1)细胞培养：取大鼠脑皮层组织匀浆，葡聚糖高速梯度离心，提取离心液底部的大鼠脑微血管段，然后通过胶原酶消化后培养获取脑血管内皮细胞，进一步通过内皮细胞免疫磁珠纯化内皮细胞，培养成功后行VIII因子相关抗原鉴定。通过离心液上部的胶质层培养，胶质细胞免疫磁珠纯化获取星形胶质细胞，行胶质纤维酸性蛋白鉴定。(2)体外血脑屏障模型的建立：接种星形胶质细胞于Transwell的下室，培养7天后，接种第3代BMEC于Transwell的上室，共同培养7天。(3)

体外血肿瘤屏障模型的建立：将C6胶质瘤细胞均匀接种于6孔板中，同时接种第3代BMEC于Transwell的上室，培养24小时后，把接种了BMEC的Transwell移到接种了C6胶质瘤细胞的6孔板中，共同培养5天。(4)

体外血脑屏障和血肿瘤屏障功能的检测：观察TEER值变化，并用透射电镜观察紧密连接及吞饮小泡的改变，用免疫荧光检测紧密连接相关蛋白ZO-1、Claudin-5和Occludin以及质膜微囊结构蛋白Caveolae中Caveolin-1、Caveolin-2的分布变化，RT-PCR法及westernblot法测定上述蛋白的mRNA和蛋白表达水平变化。(5)

研究低频超声辐照不同时间点的TEER值与紧密连接、胞吞转运之间的相关关系，明确低频超声选择性开放血脑屏障和血肿瘤屏障的作用机制。6、可行性分析

写这部分内容的时候，千万不要忘记前述的关键问题，要对能够解决所提出的关键问题进行具体说明和论证。一般应包括以下写作顺序：(1)理论上可行：研究技术思路说明，说明为什么这样做可行；(2)技术上可行：关键技术说明(关键技术要有文献标注，最好是本实验室发表的)；(3)关键实验材料：可行性说明及佐证(关键材料必须已经具备或可以获得，应附有证明,放在其他附件清单中)；(4)对所具备的实验条件进行分析；(5)对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析。7、创新性对创新的理解：创新性与先进性是有根本区的。一般包括原始创新和跟踪创新，理论创新和技术创新。

原始创新：

填补空白或修改传统的理论；新技术、新方法的发明创造。跟踪创新：

在前人工作基础上补充、完善现有理论；对原有技术、方法进行修改后产生1＋1＞2的效果。这部分内容主要从两方面写：

一是指出本研究中所从事的哪些内容迄今国内外尚没有文献报道；在写作过程当中，可以前期发现的特色性工作基础开头。切记，避免出现“首次…了”，“填补…空白”字样；二是写出本课题解决以后的科学意义（特别是能吸引人的地方）。

(1)应用低频超声辐照选择性开放血肿瘤屏障，在国内外尚无报道。申请者旨在深入研究低频超声辐照开放血肿瘤屏障的作用效果及开放的分子机制。(2)多学科交叉研究低频超声辐照不同时间的Ki值或TEER值与紧密连接、胞吞转运的相关关系，能够从理论上完善低频超声辐照开放血肿瘤屏障作用机制的研究，同时能够为选择性开放血脑屏障提供新思路、新靶点。(3)研究低频超声辐照以及低频超声辐照与缓激肽协同作用，对治疗胶质瘤的化疗药物卡铂的转运效果的影响，以及对脑肿瘤大鼠生存时间的影响，能够为脑胶质瘤的治疗提供新途径。8、年度研究计划及预期研究结果

年度研究计划：

按年度/半年列出：研究内容及其阶段目标；拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等。

预期研究结果：

理论成果：建立/丰富/补充/填补......

技术方法：建立/完善…...

专利：可望获得……

论文：国际、国内

（自然基金注重SCI收录英文论文发表）人才培养：青年科技骨干、博硕研究生

(四)、研究工作基础这部分很重要，通常应写出两部分：1、相关工作积累：含论文、专利、成果；以往工作相关技术；也可以包括学术思想与科研团队。存在问题：内容过简；与申请项目无关。2、本课题所进行的前期的实实在在的具体工作，尤其要放上与本课题直接相关的具体研究结果（不怕多,但也不要写成要申请的内容都做完了）。(1)在不同胶质瘤模型上证明了B2受体的表达程度与血脑屏障开放程度正相关[1]；证明了人脑胶质瘤上缓激肽B2受体表达存在差异，B2受体的表达水平同胶质瘤病理级别呈正相关正相关[2]；从分子水平上阐明了缓激肽开放血脑屏障的时间机制正相关[3]

，这一结果为解决临床上RMP-7选择性开放血脑屏障转运药物的问题提供了理论依据。这些为本项目提供了动物模型以及分子生物学等实验技术上的保证。

(2)应用选择性开放血脑屏障的方法研究了大鼠脑胶质瘤的基因治疗[4]，为本项目的应用研究部分，提供了保证。

(3)建立了采用低频超声辐照选择性开放血脑屏障的方法。成功掌握了提取、分离大鼠原代脑微血管内皮细胞的方法(附图3)，并且建立了稳定的脑微血管内皮二倍体细胞系及星形胶质细胞系和体外血脑屏障模型。(4)对低频超声辐照选择性开放血脑屏障的机制进行了初步探讨。……这些研究为本项目关于机制方面的研究奠定了基础。(5)有长期从事血脑屏障研究的经