食品发酵工艺学-微生物发酵过程控制-液态发酵

液态发酵工艺控制液态发酵工艺的特点液相为连续相，固相悬浮其中。影响培养效果的主要是气液两相。培养基中有可流动的游离水，微生物和代谢产物均匀分布在培养体系中。营养物质浓度均一，没有梯度，发酵均匀，固相所占比例较低，接种量较小，产物浓度低。适合于大多数微生物发酵。T、pH、溶氧浓度在线监测传输技术成熟，便于实现自动控制。供氧能耗大分离设备庞大，投资费用高，且产生大量高浓度有机废水。《食品发酵与酿造工艺学》何国庆.P96物理参数15项，生化参数17项(T,pH,P,V,密度、黏度、浊度、泡沫高度、产物浓度、无机盐浓度、空气流量、溶氧浓度、二氧化碳浓度、搅拌转速等等)发酵过程中可供检测的参数影响液态发酵的主要工艺参数温度pH氧气（溶解氧）二氧化碳基质浓度泡沫变化机理或形成机理变化规律对发酵的影响调控的方法与措施

微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的,温度是保证酶活性的重要条件,因此，温度的调控是发酵正常进行，获得产品的重要保证。

温度上升的原因对产物形成的影响对微生物生长的影响温度调控的原则和方法最适温度最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物合成各种微生物在一定条件下，都有一个最适的生长温度范围；产物合成的最适温度与生长温度往往不同。不同菌种不同的培养条件（营养、酸度、氧气等）不同的发酵阶段最适温度是不同的例如

谷氨酸产生菌最适生长30-32℃，产物34-37℃黑曲霉最适生长37℃，柠檬酸、糖化酶32-34℃青霉素最适生长30℃，分泌青霉素20℃金色链霉菌在温度≥35℃合成四环素，≤30℃合成金霉素不同生长阶段

微生物对温度的敏感性不同孢子萌发时间在一定的温度范围内，随温度的上升而缩短。对数生长期对高温的耐受能力较强。升温破坏作用不明显。所以，在适度的范围内提高对数生长期的培养温度，既有利于长菌，又可以避免热作用的破坏。处于生长后期的微生物，影响其生长的主要因素是氧气，而不是温度。所以，培养后期最好是要提高通气量。发酵温度的控制的原则长菌期控制在最适生长温度，产物合成器控制在最适代谢温度。具体操作时还需参考其他条件（如通风、培养基组成等）灵活掌握。在最适范围内，通过适当调整培养温度有目的地缩短非生物合成所占用的发酵周期，延长生物合成时间，以提高产率。发酵温度控制的方法在发酵设备上安装热交换装置（如夹套、盘管、列管等），根据安装在罐体上的温度计或传感器测得的管内料液温度及菌种的生长阶段，适当调节冷却水流量，将罐内温度维持在最适范围内。2、pH对发酵的影响及控制

变化的原因及变化规律最适pH值和耐受pH值对M生长和代谢的影响规律和影响机理调控方法最适pH值1、同一种微生物的生长最适pH与

代谢最适pH值可能不同2、每一类微生物都有其最适的pH和能耐受的pH范围几类微生物的最适生长pH大多数细菌:6.5–7.5霉菌和酵母菌:4-6放线菌:6.5-8谷氨酸发酵前期pH值7.5，中期pH值7.2，后期pH值7.0，接近放罐时为了后续提取工艺，pH值以6.5-6.8为好。同一发酵过程中不同阶段的最适pH:同一种微生物生产不同产物时，最适代谢pH值不同黑曲霉：发酵生产柠檬酸时的最适代谢pH值2~3，生产草酸时的最适代谢pH值接近中性。酵母：酒精4.5-5.0，pH值为8.0时，产物为酒精、乙酸和甘油。

棒杆菌:pH5.0-5.8产生谷氨酰胺,

中性产生谷氨酸

pH变化对微生物

生长和代谢的影响机理pH变化会影响酶活性中心上有关基团的解离，引起各种酶活力的改变。影响底物（培养基成分）的解离，从而影响酶与底物的结合，使底物得不到很好的利用，从而影响菌体的生长，或代谢途径的改变。影响细胞膜电荷，膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排出。pH变化对微生物生长和代谢的影响pH值超出微生物的耐受范围，微生物将会死亡。北京棒状杆菌AS1.299—5.0~10.0pH值超出微生物的最适生长范围，微生物的生长将会受到抑制，细胞形态会改变，生长繁殖的速度会变。AS1.299—6.5~7.5pH值超出某一产物特定的最适代谢pH值时，菌种的代谢途径有可能会改变，代谢产物的种类和含量也就会发生改变。导致发酵过程中pH值

发生变化的因素灭菌发酵基质中氮源的消耗发酵过程中产物的形成菌体自溶阶段，培养液中的氨基氮增加,使pH上升。

发酵过程中引起发酵液pH值下降的具体情况酸性物质的生成或释放、碱性物质的消耗都会引起pH值的下降。例如：碳氮比不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量或中间补糖过多，如果加上溶氧不足，会导致有机酸大量积累，引起pH值下降。生理酸性物质（如硫酸铵）加入过多，当氨根离子被利用后，余下的硫酸根离子会导致发酵液pH值下降。发酵过程中引起发酵液pH值上升的具体情况凡是碱性物质的生成或释放、酸性物质被利用都会引起pH值的上升。例如：培养基氮源过多，-NH2的释放会引起pH值的上升。生理碱性盐（硝酸钠）中的硝酸根被利用，或培养液中有机酸被利用，都会引起pH值的上升。中间补料时加入氨水或尿素等碱性物质过多会引起pH值上升。在菌种、培养基组成及培养条件确定的情况下，发酵过程中醪液pH值的变化具有一定的规律性。因此，通过在线检测pH值，可以了解发酵状况是否正常。

发酵过程中pH的调控方法调节培养基组成：调节培养基的原始pH值，并加入缓冲溶液如磷酸盐制成缓冲能力强、pH值变化不大的培养基。调整培养条件：调整通风量和搅拌转速，从而改变溶氧浓度，控制有机酸的积累及其代谢速度；通过改变罐压及通风量从而改变醪液内二氧化碳的浓度来影响pH值；在适度范围内调整培养温度以控制微生物的代谢速度。外加物质调整：自动控制连续流加液氨或氨水或尿素，既可调pH值又可作氮源。其他方法

酶制剂、抗生素发酵通过加糖、淀粉来控制pH。青霉素根据代谢需要，改变加糖速率，比固定加糖而用酸碱调节pH增产25%pH值自动控制系统复合电极将pH值转化为毫伏电信号-----经pH变送器转换成标准统一信号-----调节器经调节规律运算输出控制信号----启动执行机构加入pH调节剂---最终达到精确控制pH值的目的。还可在pH变送器后接上记录仪，以便对发酵全过程的pH值变化进行跟踪记录。3、二氧化碳的控制二氧化碳的来源二氧化碳对微生物菌种的影响二氧化碳的作用机制二氧化碳的工艺调控措施二氧化碳对微生物生长

和发酵的抑制作用对酵母的抑制作用：进气中二氧化碳含量达80%时，酵母活力与对照相比下降20%；发酵液中浓度达0.16mol/L就会严重抑制酵母细胞的生长。排气中二氧化碳达40%，微生物的呼吸速率和糖代谢速率明显下降。（啤酒）二氧化碳对抗生素、肌苷酸、组氨酸、异亮氨酸的发酵有明显的抑制作用。例：二氧化碳对细胞抑制作用的机制a、影响发酵液酸碱平衡，改变pH值，或与其他物质发生化学反应，或与微生物生长必需的金属离子结合形成沉淀。b、

二氧化碳影响细胞膜的结构：当细胞膜的脂质相中二氧化碳达临界值时，使膜的流动性及表面电荷密度发生变化，导致许多基质的膜运输受阻，影响细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，细胞生长受到抑制，形态也会随之发生改变c、在某些合成途径中对前体物的合成产生反馈抑制

二氧化碳效应（促进作用）环状芽孢杆菌已经发芽的孢子在开始生长时对二氧化碳有特殊需要二氧化碳是大肠杆菌和链霉素突变菌株的生长因子，菌体有时需含二氧化碳30%的气体才能生长。牛链球菌发酵生产多糖，最重要的条件是供气中必须含有5%的二氧化碳。精氨酸发酵时，二氧化碳分压达12000帕时，获得最大产量。二氧化碳浓度的控制发酵罐中CO2分压是液体深度的函数：主要采用通气搅拌的方法控制改变罐压：酒精、啤酒发酵通气搅拌：四环素发酵碱性物质中和4、溶解氧浓度对发酵的影响及监控

对多数发酵来说，氧的不足会导致代谢异常，产量降低。随着高产菌株的广泛应用和丰富培养基的采用，对溶氧要求更高。

氧气难溶，因此，溶解氧常常是发酵生产的限制性因素。保证溶氧的供给是稳定和提高产量，降低生产成本的关键之一。

溶氧浓度的表示方法影响供氧效果的因素影响微生物耗氧的因素微生物耗氧情况的表示方法控制溶氧的工艺手段溶氧可作为发酵是否正常的指示污染好气性杂菌,耗氧量增加溶氧浓度降低污染噬菌体，活细胞数量下降，摄氧率下降，溶氧浓度增高。操作故障或事故引起的发酵异常百分饱和度

百分饱和度是最常用的溶氧浓度表示方法之一。在一定温度下，培养液被空气完全饱和时，即为溶氧100%饱和度，室温下为7mg/L左右。

临界氧浓度

指不影响微生物的呼吸所允许的最低氧浓度。低于该浓度，首先影响微生物的正常呼吸，进而造成代谢异常。

生物合成最适氧浓度

生物合成的溶氧浓度有一最适范围，有下限，也有上限，与临界氧浓度是不同的概念。例如：谷氨酸发酵的产酸阶段，溶解氧供应不足，合成丙酮酸以后的氧化反应就会停止，进而转化为乳酸。生产上表现为耗糖快、尿素消耗快、pH值下降，长菌而不产谷氨酸。如果供氧过量，又不利于α-酮戊二酸的积累，影响谷氨酸的产量。供氧方程（气液传质速度方程）dC/dt=Kla

(C*-C)dC/dt–单位时间内培养溶液氧浓度的变化C*-在罐内氧分压下培养液中氧的饱和浓度C-测定的氧浓度a-比界面面积K-溶氧系数

由此可知：凡是影响溶氧系数的因素（培养液成分及状态、设备容积与髙径比等）、两相界面以及两相中氧气浓度，均会影响氧气的传递速度，影响供氧效果。影响供氧的因素发酵液的性质发酵罐内液柱的高度和罐容搅拌与折流挡板罐内压力通气量及通入气体的成分KaC*C发酵液性质对供气效果的影响发酵液黏度增加，气泡外滞流液膜的厚度增加，传质阻力会加大，K降低，是通气效率降低。细胞浓度及菌丝形态的影响：a、细胞浓度越大，溶氧系数越小。b、球状菌体比丝状菌体的K大两倍。发酵液的泡沫：泡沫中氧的分压很小，二氧化碳的分压很高，且泡沫不容易破碎，因此，会对氧的传递造成不良影响。发酵罐内液柱的高度和罐容的影响高径比越小，氧的利用率越差：从一增至二，溶氧系数可增加40%；从2增至3，溶氧系数可增加20%；如果继续增大径高比，则溶氧系数增加不明显。国内一般用2-3，国外3-5。几何形状一致的罐，容积越大，气液接触时间越长，氧的溶解率越高。因此，要保持同样的溶氧系数，大罐所需的搅拌转速和风量均小一些。例谷氨酸发酵：

50L----通气量0.5：1，转速340r/min;250L---通气量0.3：1，转速300r/min500L---通气量0.25：1，转速230r/min搅拌对溶氧的影响

采用机械搅拌是提高溶氧系数的有效方法。搅拌可以改善罐内液体的混合和循环,从而具有抑制气泡聚合的效果,而且可以避免低于平均氧浓度的死角存在。

a、使大气泡变小，阻止小气泡合并变大。

b、发酵液湍动，可减小气泡周围液膜的厚度，减小传质阻力，使传质系数增加。

c、使液体形成涡流，延长气液接触时间。

d、使菌体分散，避免结团，增加固液接触面，使溶氧吸收的推动力均一，也减小菌体表面液膜的厚度，有利于氧的传递。

在一定范围内，溶氧系数随着通气量的增加而增大，但并非没有限度。当通气量达到某一数值时，搅拌器就不能有效地将气体分散，而是在大量的气泡中空转，发生过载现象。大气泡沿轴周围上升，搅拌器功率大大下降，溶氧系数不再增加。例如：开放式涡轮平浆式搅拌器的过载空气流速21m/s；一般搅拌器用一个桨叶时90m/s，两个桨叶时150m/s.挡板

通过挡板的剪切作用,使液体在形成中心下降的漩涡时产生轴向运动，从而提高气液混合效果，避免低于平均氧浓度的死角存在。

4~6块，宽为罐径的0.1~0.12，高为罐底至液面，与罐体内壁间距（1/5~1/8）D。据报道：增设一块挡板，通气效率可以增加20倍之多。-----《微生物工程》曹军卫P113.通气气体成分

用通入纯氧方法来改变空气中氧的含量，提高了C*值，因而提高了供氧能力。纯氧成本较高，但对于某些发酵需要时，如溶氧低于临界值时，短时间内加入纯氧是有效而可行的，这种方法在实验室动植物细胞培养中已被采用。其他富氧装置也在开发，但因成本核算问题及安全问题，离实际工业生产使用还有距离。通气量

通气量:通气的气速与发酵液体积之比。装有搅拌器的发酵罐内溶氧系数与表观空气速度的关系如图：

罐压对溶氧的影响

提高罐压，增加C*，从而提高供氧能力，但此法不是十分有效。主要原因是：

(1)提高罐压就要相应地增加空压机的出口压力，也就是增加了动力消耗。

(2)发酵罐的强度也要相应增加。

(3)提高罐压后，产生的二氧化碳溶解量也要增加，会使培养液的pH值发生变化，这些对菌体生产都极为不利。

控制溶氧的工艺手段控制溶氧的工艺手段主要是从供氧和需氧两方面来考虑，工艺上主要的控制手段有以下几种：

改变搅拌转速改变通气速度改变通入气体中氧的分压改变罐压改变发酵液的理化性质加入传氧中间介质。溶氧自动控制系统溶氧控制的调节手段选定以后，就可以设计溶氧自动控制系统，以满足生产的需要。工业上普遍采用的是把搅拌转速或空气流量作为调节参数，溶氧作为被调参数。常用的自控系统有：改变流量的溶氧控制系统；改变搅拌转速的溶氧控制串级调节系统；改变搅拌转速、通气量、罐压所组成的溶氧控制串级回路。5、发酵基质对发酵的影响及补料控制发酵基质概念：发酵培养液中除了菌体和水分之外的所有干物质的统称。作用：为微生物的生长和代谢提供物质基础；为生物合成产物提供原料；既是培养基组分，又是生产的原料。选用：大多采用的是天然的有机C、N源。首先考察原料质量，除了外观、水分、灰分、C、N等理化指标外，更重要的是要通过实验来确定其对发酵的影响。基质浓度过低，菌体生长缓慢，生物合成慢适中，菌体生长迅速，生物合成快过高，会抑制菌体生长，引起碳分解代谢物阻遏现象，阻碍产物形成补料控制基质浓度

一次性投料的缺点：养分主要消耗在长菌上，产物合成阶段养分不足，导致菌体过早自溶，因而合成期短，产率低。

流加补料法：为解除基质过浓的抑制,产物的反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应,采用中间补料的培养方式，控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。流加料为基础料的1-3倍。

鉴于目前对微生物的代谢规律尚未充分掌握，现有的各种补料措施都是通过实验方法确定的。补糖补糖时机的选择：根据残糖含量、pH值、或菌体形态等综合判断，确定补料时间。补糖的方式：一般以间歇定时加入为主，近年开始用连续滴加的方式。后者可避免一次性加入大量糖分而引起菌体代谢受环境突然改变的影响。控制指标：还原糖或总糖。举例甘蔗糖蜜发酵生产谷氨酸：初糖6.5-7.5%，初定容52%---天津棒杆菌B9，OD值净增0.25-0.3时加土温600.2%---发酵16小时左右，残糖降到1.5-2.0%时，流加12%-13%的糖蜜至罐容的70%-35℃下发酵32hr，产酸率4.5%-5.0%，转化率40%左右。甜菜糖蜜生产味精：初糖7%，中间补加浓度为36%的糖蜜三次，使总糖达到12.7%，发酵41小时，产酸率达5.51%，转化率43.4%。四环素发酵：发酵45hr后补糖，发酵周期可延长到120-130小时，发酵单位可达10000-12000微克/ml.对照组72.9小时达最高，为5500-7000微克/ml。补氮补氮的作用：既可延长代谢产物的分泌期，又可调节pH值。还可纠正异常发酵。例如青霉素发酵过程，当菌丝膨胀成葫芦状、不降糖时，加尿素液有明显作用。土霉素发酵前期补加2-3次酵母粉，放罐单位比对照组约高1500μ/ml.流加方式：成细流加入或将流加管道接入空气分布管内借气流送入，很快与培养液混合均匀，以避免造成局部过碱。磷酸盐浓度当遇到菌体生长迟缓、耗糖低、则需添加磷酸盐以促进糖代谢。微生物生长良好所允许的浓度0.32-300mmol/L;次级代谢产物合成所允许的浓度为1.0mmol/L,提高到10就明显地抑制合成。最适浓度取决于菌种特性、培养条件、培养基组成及来源。

总之，补料工艺是控制中间代谢的较为灵活的措施，不同的微生物菌种，或培养条件不同，控制方法也略有差异，不能相互照搬套用。需根据具体情况通过时间确定最适的中间控制方法。谷氨酸发酵的中间代谢控制适应期：0-3hr,个体长大，无分裂，不耗糖或耗糖极低,最适生长温度30-34

℃对数生长期：3-8hr或4-10hr,代谢旺盛，大量繁殖、OD值直线上升，菌体呈V形分裂，氮源大量消耗、pH下降，应及时流加尿素；温度上升（一般5hr），应及时降温；耗氧增加，产生的二氧化碳增加，应根据情况提高风量。对数生长末期为了促进增殖型菌体向生产型转化，更需充足的风量和尿素。转化期：细胞开始伸长、膨胀、耗糖最快、耗氧最多、产热最多、泡沫显著增加。此阶段的控制是发酵成败的关键。受生物素和风量的影响最为明显。产酸期：菌体呈花生形。大量积累谷氨酸，应保证充足的N源，温度控制在36-37℃，pH7.0-7.2，继续通风。末期：减小通风量，少量流加尿素，残糖降到1%以下停止通风。泡沫控制泡沫产生的原因培养基中糖,蛋白质,代谢物等稳定泡沫表面的活性物质的存在通气、搅拌：外界引进的气流被机械分散形成泡沫。代谢气体的逸出：产生的气体凝集形成泡沫。培养液黏度、细菌体对泡沫有稳定作用。所以，当感染杂菌、噬菌体、菌体自溶时泡沫特别多。泡沫对发酵的危害降低了发酵罐的装料系数,设备利用率降低增加了菌群的非均一性,微生物随泡沫漂浮

泡沫大量产生,造成“逃液”现象，导致产物的损失发酵液从轴封渗出，造成染菌影响通风搅拌正常进行，影响氧的传递，并且，产生的废气不能及时排除，会妨碍菌的呼吸，甚至会造成菌体的自溶。加入消泡剂给提取工序带来困难一个发酵周期内泡沫消长的基本规律长菌期：糖、蛋白质浓度高，对数生长期需氧量大，是产泡高峰期，泡沫的稳定性也最强。产物合成期：C、N源逐渐被利用，培养基表观黏度下降，促使泡沫表面张力上升，泡沫寿命会逐渐缩短，泡沫高度会逐渐下降。发酵后期:菌体自溶，可溶性蛋白质的浓度增加，又促使泡沫的稳定性增加。泡沫虽然不多，但难以彻底消失。泡沫的防止和消除减少起泡的措施：（1）减少起泡物质和产泡外力（2）选育生长期不产泡的突变菌株。（SCP生产中已经初见成效）。化学消泡法

化学消沫作用——当消泡剂加入到发泡体系中，由于消泡剂的表面张力低（相对于发泡体系），在消泡剂接触液膜面时，成为泡膜的一部分，使液膜面扩大，变薄，同时使泡膜局部表面张力降低，力的平衡被破坏，在力的作用下气泡破裂、合并，最后导致泡沫破灭。

化学消泡法的优缺点优点：来源广泛、效果好、作用迅速、用量少、不需改造设备，便于实现自动化。缺点：降低氧的吸收率约1/5-1/3。添加时增加了染菌的可能性；增加下游提取分