DB52∕T 1114-2016 贵州省昆明裂腹鱼种质标准

2016-04-01发布2016-10-01实施贵州省质量技术监督局发布I I 1 13术语与定义 1 1 1 4 4附录A(规范性附录)检测方法与同工酶各种试剂的配制 8附录B(规范性附录)染色体各种试剂的配制 ·························本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准由毕节市畜牧水产局提出并归口。本标准主要起草单位：毕节市水产技术推广站、贵州省水产技术推广站、毕节市鑫有农业综合开发有限责任公司、贵州大学动物科学学院。本标准主要起草人：詹会祥、晏宏、周礼敬、安苗、刘朝琴、王朝荣、杨林、刘桂兰、周训才。本标准的附录A和附录B为规范性附录。11范围本标准给出了昆明裂腹鱼(SchizothoraxschizothoraxgrahamiRegan,1904)的术语与定义、符下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18654.1养殖鱼类种质检测第1部分：检测规则GB/T18654.2养殖鱼类种质检测第GB/T18654.12养殖鱼类种质检测第12部3术语与定义昆明裂腹鱼Schizothorax(schizothorax)grahami(Regan),1904地方名：细鳞鱼腹鳍均呈青灰或浅黄色，尾鳍呈浅红色；属于冷水性底层鱼类，a)D.iii-8:指昆明裂腹鱼背鳍的不分枝鳍条3条和8条软条；b)A.iii-5:指昆明裂腹鱼臀鳍的不分枝鳍条3条和5条软条；c)P.i-18~20:指昆明裂腹鱼胸鳍的不分枝鳍条1条和18~20软条；d)V.i-9~10:指昆明裂腹鱼腹鳍的不分枝鳍条1条和9~10软条；e)Tris:指一种溶于乙醇和水的白色结晶或粉末，中文名为三羟甲基氨基甲烷；g)AP:指一种用于氧化剂和漂白剂的过氧化物，中文名为过硫酸铵。2隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、裂腹鱼属5.2.1外形5.2.1.4须部背鳍末根鳍条不分枝，其后缘每侧具12枚~20枚细小锯齿或仅为锯齿5.2.1.7胸腹部5.2.1.8臀尾部3图1昆明裂腹鱼的外形图5.2.2可数性状按照GB/T18654.1和GB/T18654.3的规定执行，获得以下结果：——背鳍鳍式：D.iii-8;——侧线鳞：——第一鳃弓鳃耙数：外侧17~20,内侧20~25。5.2.3可量性状按照GB/T18654.1和GB/T18654.3的规定执行，获得体长17.0cm~31.0cm,体重101.0g~510.0g的个体实测性状比值见表1。表1实测可量性状比例值5.3内部构造鳔2室，其后室为前室长的2.0倍~2.5倍。5.3.2脊椎骨脊椎骨总数为48。5.3.3下咽骨4下咽骨狭窄，呈弧形，其长度为宽度的3.8倍~5.0倍。5.3.4下咽齿下咽齿3行，2.3.5~5.3.2;细圆，顶端尖而稍钩曲，咀嚼面凹入呈匙状；内行第一枚齿细小。腹膜黑色。肠管长为体长的1.9倍~3.2倍。6生长与繁殖按照GB/T18654.2的规定执行，获得不同年龄组鱼的全长与体重实测值见表2。表2昆明裂腹鱼全长与体重实测值年龄/龄6.2.1性成熟年龄：雄鱼3龄，雌鱼4龄；最佳繁殖年龄：雄鱼4龄~8龄，雌鱼5龄~9龄。6.2.2产卵类型：沉性卵。6.2.4怀卵量：不同龄性成熟个体的怀卵量见表3。表3昆明裂腹鱼个体怀卵量567相对怀卵量(粒/g体重)7遗传学特性7.1生化遗传特性7.1.1乳酸脱氢酶(LDH)图谱昆明裂腹鱼尾鳍和性腺组织中乳酸脱氢酶(LDH)同工酶电泳图谱见图2,呈典型5条酶带。5+性腺昆明裂腹鱼肌肉组织中苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶电泳图谱见图3。分为移动速度较快的细胞质型++6SF二°EST-8体细胞染色体数：2n=132,臂数(NF):196,图6昆明裂腹鱼的染色体核型7.3随机扩增多态DNA(RAPD)分子遗传特性大小为200bp~1600bp。引物P04扩增昆明裂腹鱼种群的电泳图谱(见图7)。20条引物在昆明裂腹鱼中检测到的总位点数为121个，多态位点数为57个，多态频率为47.11%(见表4)。7=引物编码序列(5'-3')735242646283537342537362562516352855364合计(Total)47.11%见(表5)。8A.1.1年龄鉴定A.1.1.1材料A.1.1.2操作步骤b)用40nm~60nm细度磨石或700#粒度金相砂纸两面磨制平面(镜检可清晰见到轮纹)清洗，中c)在解剖镜下观察年龄，确定鱼的年龄。A.1.2繁殖力测定在繁殖季节，取出性成熟雌鱼卵巢(IV),称重后，在前、中、后部各称取1.0g卵巢组织，用10%甲卵量；单位体重(g)所含的卵粒数为相对怀卵量。A.1.3同工酶分析——主要仪器：FA1004型号的电子天平(上海良平仪器仪表有限公司，精度为0.1mg)、型电泳槽(北京市六一仪器厂生产)、凝胶成像系统(SYNGNE);B-醋酸萘酯、固牢蓝RR盐。A.1.3.2样品制备各1g~2g,随后快速分装并投入液氮中，带回实验室置于——称取约0.3g组织于匀浆器内，加入预冷PBS缓冲液(0.1M,pH=7.0),在冰浴上研磨提取粗液。肝脏和性腺按1:4加入缓冲液，肌肉和尾鳍则按1:3加入缓冲液；——研磨液在10000rppm,4℃下冷冻离心。肌肉和尾鳍各离心2次，第1次离心时间为20min,第2次为30min;肝脏和性腺离心3次，第1次离心时间为20min,第2次为30min,第3次为10min。上清液按1:1比例加20%蔗糖溶液分装。混合均匀后保存于-20℃冰箱中供分析用。9——采用高pH不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳法。ADH和EST所用分离胶浓度为7.5%(pH=8.9),另2种酶为5%。浓缩胶浓度都为3%(pH=6.7)。电极缓冲液为Tris-甘氨酸(0.1M,pH=8.3);——初始电压为100V,待溴酚蓝指示剂进入浓缩胶后将电泳槽置于4℃冰箱中。指示剂进入分离胶后将电压调到220V,继续电泳，待指示剂距分离胶底部1cm时停止电泳，全过程4h~5h;——电泳结束后，放入预先配好并在37℃恒温箱中保温的同工酶染色液中染色(溶液配方标准见附录A)。倒出染色液，用蒸馏水冲洗凝胶2~3次，加入5%的冰乙酸固定。随后在凝胶成像系统中进行拍照保存图片。同工酶的缩写、基因座位和等位基因命名采用Shaklee等(1967)所推荐的标准。酶的编号以向阳极泳动最快的编为1号，依顺序编为2,3,4,…。最后将凝胶A.1.4染色体检测A.1.5分子遗传特性检测A.1.5.1仪器和试剂PCR仪(TECHNETC-512)、紫外分光光度计-752型(上海菁华科技仪器有限公司)、DNA聚合酶、2×ReactionMix(天根生化科技〈北京〉有限公司)、引物(上海生物工程技术服务有限公司)、250bpDNALadderMarker、DNA提取纯化试剂盒DV811(宝生物工程〈大连>有限公司),其它药品和试剂均A.1.5.2样品采集取活鱼背部肌肉2g~5g,用料塑袋封装后迅速投入液氮保存待用。图A.1昆明裂腹鱼肌肉组织提取的基因组DNA电泳检测图循环，每个循环为94℃变性60s,37.1℃复性60s,72℃延伸90s,首次循环前94℃预变性5min,最后一琼脂糖凝胶(称取0.56克琼脂糖放入40ml10×TBE缓冲液中，用电炉加热充分溶解均匀得到)进行电泳，4500bp,共8条带)作为分子量标记。凝胶用EB(溴化乙锭)染色后经凝胶成像系统成像，然后进行统A.2.1凝胶制备溶液配制丙烯酰胺单分离胶缓冲18.16gTris溶解在60ml双蒸水中，用1N的盐酸调pH至8.9,再用双蒸水稀释至100ml,在4℃保存备用。浓缩胶缓冲3.03gTris溶解在60ml双蒸水中，用1N的盐酸调pH至6.8,再用双蒸水稀释至100ml,在4℃保存备用。电极缓冲液称0.6gTris和2.88g甘氨酸溶于双蒸水中，调节pH至8.3,定容到名称分离胶系统(5%)分离胶系统(7.5%)用量(ml)用量(ml)加双蒸水到100ml加双蒸水到100ml浓缩胶系统(3%)名称用量(ml)加双蒸水到100ml加水到100ml酶名称染色配方酯酶(EST)蓝。乳酸脱氢酶(LDH)1MDL-乳酸钠溶液(pH7.0)10ml,0.1MNaCl溶液5ml,0.5MTris-HCl(pH7.4)15ml,NAD+50mg,NBT30mg,PMS2mg加双蒸水至苹果酸脱氢酶(MDH)PMS(1%)10.5mg,1M苹果酸钠溶液(pH7.0),加入双蒸水至100ml。乙醇脱氢酶(ADH)0.2MTris-HCl(p