第九章 特殊染色

章特殊染色

2021/6/271

一、特殊染色的概念及意义

特殊染色为常规染色（即苏木素、伊红）的必要补充，又称选择性染色，只有相对的特异性，如PAS阴性反应它有糖元。

2021/6/272意义：

（1）特染能显示在常规染色切片中不明显的部分，如革兰氏染色、细菌染色。

（2）区别HE染色中不能鉴别的组织病变，如VG染色区别胶元纤维和平滑肌。

（3）显示某些常规染色中不能着色的物质，如网染才能显示网状纤维，常规HE染色是染不出来的。

因此，特殊染色也是制片染色中不可缺少的组成部分，它在病理诊断常着辅助作用，也为科研提供依据。

2021/6/273二、学习特染技术应掌握的重点

（注意事项）

（1）染色方法的成败，应该在温度、浓度、时间和PH值等方面找原因。

（2）注意特染的应用范围，如某种病变应用什么方法染色才能达到目的，一般先在HE切片所见的要求去选择适当的特染方法，一种或多种。

2021/6/274（3）必须掌握各种特殊染色的结果，避免导致错误的结论或严重的误诊，如在网染时把胶元纤维误以为网状纤维。

（4）尽量要阳性切片作对照，便于选择特染方法，并与HE切片作对照。

（5）特染的组织，在其固定、脱水根据要求选择。所用的器皿都必须化学清洗。

2021/6/275三、玻璃器皿的清洁

在病理实验室可用的玻璃器皿，都必须经过清洗干净才能使用，清洗的方法依玻璃器皿的新旧而不同。2021/6/2761、新购玻璃器皿的处理

对于新购买的玻璃器皿应先用洗衣粉浸泡洗刷，自来水冲洗后再用1—2%盐酸水溶液浸泡数小时后，用自来水冲洗干净，必要时可用少量蒸馏水洗2次2021/6/2772、使用后玻璃器皿的处理

每次使用后的玻璃器皿都必须及时彻底清洗干净，以供下次实验之用，如轻视这一步骤，可用的玻璃器皿不够干净，则会影响染色效果，甚至导致染色失败，特别在酶组化和银离子反应操作过程中更有严格的要求，使用后的玻璃器皿在一般清洗后，还要求用硫酸清洗液浸泡。2021/6/278

硫酸清洗液配制

重铬酸钾80g

自来水1000ml

浓硫酸（工业用）120m

新配制的清洁液为红褐色，反复使用一段时间后，慢慢变成绿色，说明清洁液已失败，不能继续使用应重新配制。2021/6/279

3、玻璃器皿的清洗方法

①任何玻璃器皿都必须用自来水冲洗，然后把残余药液或染液洗去。

②用毛刷沾洗衣粉擦干净。

③自来水冲洗，蒸馏水洗2次。

④把晾干的器皿轻轻置入清洁液浸泡数日。

⑤取出器皿，用自来水把器皿内外彻底冲洗干净，最后用蒸馏水洗2次。

⑥把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或温箱中烤干，最后存放橱内备用。2021/6/2710

常用的特染

第一节结缔组织染色2021/6/2711一、胶元纤维染色（VG染色）

㈠胶元纤维的分部组成成分

胶原纤维是结缔组织中的三种纤维之一，分布最为广泛，含量最多。主要分布于真皮、腱、韧带、骨、透明软骨、动脉、肠壁、子宫和基底膜等。胶原纤维具有韧性大，抗拉力强的特点。胶原纤维单位主要由纤维母细胞合成。2021/6/2712

苦味酸—酸性品红法

1．VG染液试剂配制

1%酸性品红10ml

苦味酸饱和液90ml

此液常分别配制临用时加以混合，不能久用。2021/6/2713

【染色步骤】

（1）组织固定于10%早醛液中，常规脱水包埋

（2）组织切片脱腊至水。

（3）V-G染液2-5’（酸性品红1：苦味酸饱和液9）

（4）倾去染液，无水酒精急速脱水，用滤纸吸干

（5）二甲苯透明，中性树胶封片。

2021/6/2714【结果】

胶元纤维呈红色，肌纤维、胞质及红细胞黄色。2021/6/27152021/6/2716

㈡胶元纤维染色应用

胶原纤维染色在病理诊断上主要用于鉴定梭形、纤维形细胞肿瘤的组织来源；

常常要在纤维、平滑肌和神经三者之中作出选择。

观察动脉硬化的心脏，在HＥ切片中，心肌内散在的小疤痕灶和心肌均被染作红色，而作胶原纤维染色可将胶原组织和肌肉上明显地区分开来。

早期肝硬化用胶原纤维染色，也可使小叶之间少量增生的胶原纤维突出地显示出来。2021/6/2717二、

网状纤维染色

㈠网状纤维染色的形态特点和染色原理

网状纤维是网状结缔组织内的一种纤维。它由网状细胞产生，网状纤维细而有分支，穿行于细胞体和突之间，共同构成网状支架。这种纤维用HE染色一般不易辨认。若用银氨溶液浸染能使纤维变成黑色，故又称嗜银纤维。2021/6/2718（二）网状纤维染色的原理

网状纤维的染色方法很多，但是染色原理基本相同，有以下方面。

（1）氧化使网状纤维具有选择性，不经氧化的切片，常用的氧化剂是高锰酸钾。

（2）漂白一般采用2%草酸，漂白后无色2021/6/2719（3）媒染多用2%硫酸铁氨（俗称铁明矾）。这些试剂可增加网状纤维对银氨液的选择性。

（4）浸银也称镀银，使银氨配位化合物与网状纤维结合，带正电荷的二氨合银Ag（NH3）+2被具有嗜银性物质的网状纤维吸附。

（5）还原甲醛液是还原剂，能把与网状纤维结合的银氨配位化合物还原成棕黑色的金属银。

2021/6/2720

（三）网状纤维纤维染色应用

判定病变组织支架的破坏情况，组织、脏器网状支架的存在与塌陷、完整与破坏、网状纤维的分布及走行，有多少、粗细、疏密或有无断裂形态变化。

2021/6/2721⑴用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源

显示和区分癌与肉瘤来源于上皮组织的恶性肿瘤（癌）仅癌巢周围有网状纤维包绕，巢内癌细胞之间则没有网状纤维分部。来源于间叶组织的恶性肿瘤（肉瘤），瘤细胞之间往往可见较多的网状纤存在。

2021/6/2722⑵用于某些肿瘤的诊断

根据染色所显示的网状纤维多少、分布及行走特点，可用于诊断下列肿瘤。2021/6/27231）平滑肌肉细胞之间见有大量平行分布的网状纤维。

2）纤维肉瘤可见大量网状纤维存在，并且密集包绕细胞。

3）滑膜肉瘤其梭形细胞也产生网状纤维，但不如纤维肉瘤多。2021/6/2724⑶用于观察和研究癌组织的发生、发展及其恶性程度

癌组织发生，发展过程以及癌组织生长速度，可通过网染进行观察和研究，如癌巢周围的网状纤维包囊完整，说明癌组织生长较慢，恶性程度低；再如子宫颈鳞状细胞癌巢周围网状纤维分解，说明癌组织正在扩散，其恶性程度较高。2021/6/2725(5)用于显示和研究肝组织病变

用网状纤维的染色法，观察肝脏病变处的网状支架形态、分布特点及其破坏情况，可以判定和研究其病变性质、程度及其发展与转规。

2021/6/2726（四）网状纤维染色的注意事项

（1）用新蒸馏水配制最好用双蒸水配制。

（2）所用玻璃器材及载玻片均要达到化学洁净程度.

（3）对已配制好的硝酸银液和氨银溶液，要贮存冰箱中保存待用。

2021/6/2727（4）在染色过程中，用染氨银染液或硝酸银液的前后应用蒸馏水洗浸。

（5）氯化金调色和硫代硫酸钠固定的时间不应太长，否则会引起网状纤维染色变淡。

（6）切片脱水后及时封片，不宜在空气中停留时间过长，以免产生色素颗粒。2021/6/2728

【氨银液的配制】

1.取10%硝酸银水溶液5ml于三角烧瓶内，一滴一滴地滴加氨水（氢氧化铵），并同时摇动容器

2.硝酸银遇到氨水立即产生沉淀，当其沉淀物被溶解时（不能完全溶解也可）

3.再加入3%氢氧化钠水溶液5ml。溶液重新产生沉淀

4.此时再滴加氨水。至其沉淀被溶解后，（为避免氨水加入过量最好能有少许沉淀物为妥，以免脱片）最后加蒸馏水稀释至50ml。

5.滤过，贮存于棕色瓶中存放入冰箱备用。临用前取出恢复室温再用。2021/6/2729【染色步骤】

（1）切片脱蜡至水洗。

（2）0.25%高锰酸钾液氧化5’。

（3）自来水洗2次。

（4）2.5%草酸液漂白1-2’，水洗2’。

（5）2%硫酸铁铵媒染（铁明矾）10’。

（6）水洗，蒸馏水洗2次。

（7）滴染氨银液1’左右。2021/6/2730（8）蒸馏水洗2次。

（9）10%中性早醛还原3′。

（10）蒸馏水洗1—2次。

（11）0.2%的氯化金调色5′

水洗。

（12）5%硫代硫酸钠固定5′。

（13）自来水冲洗，蒸馏水洗。

（14）复染（对比染色）伊红、中性红、ＶＧ。

（15）脱水、透明、封片。

2021/6/2731【结果】

胶元纤维呈黄色，网状纤维成黑色。2021/6/2732

【染色结果】

网状纤维染灰黑色，胶元纤维红色，基质黄色。

2021/6/2733三、弹力纤维染色法

弹力纤维较细，直径0.2-1微米，且坚固，弹性大，容易伸展，纤维分枝连接成网，HE染色与胶原纤维着色相似，若用弹力纤维染色法，则可分辨的很清楚。2021/6/2734Weigert氏弹力纤维染色法：标本用Zenker氏液，酒精或10%甲醛固定均可。石蜡或冰冻切片。脱蜡至水。水洗后，加入Weigert氏染色液2-6小时或更长的时间，一般依染色液的新旧而定。2021/6/2735取出后，直接浸入1%盐酸酒精或酒精中进行分化。如需复染细胞核，可染于明矾苏木素溶液中10分钟。冲洗后，可再以VG氏染液作对比染色1-2分钟。95%酒精分化、脱水、透明、封固。2021/6/2736试剂配制：盐基性复红（碱性品红）2g间苯二酚（雷锁辛）4g蒸馏水200ml30%三氯化铁水溶液25ml95%酒精200ml浓盐酸4ml2021/6/2737先将盐基性复红（碱性品红）溶于200ml的蒸馏水中，加入4-5g间苯二酚，加温煮沸（不停搅拌），然后加入25ml的30%三氯化铁水溶液，继续搅拌煮沸2-5分钟，冷却后过滤倾去滤液，将滤纸及沉淀物置于温箱中烘干。而后将滤纸和干燥的沉淀物一并投入烧杯，加200ml95%酒精，小心隔水加热，徐徐搅拌使沉淀溶解，然后弃去滤纸冷却后，补足因加热蒸发的酒精。最后加入4ml的盐酸即可应用。（对苯二酚可代替间苯二酚）。2021/6/2738【注意事项】

Weigert氏弹力纤维染色的配制已有许多改变，盐基性复红（碱性品红）可由其它盐基性染料取代，配制时如将结晶紫1克加盐基性复红1克，则弹力纤维染成兰绿色；全用甲紫或结晶紫，弹力纤维则呈暗绿色。2021/6/2739【染色结果】

弹力纤维蓝黑色，胶原纤维染成红色，肌纤维染成黄色。2021/6/2740小动脉光镜图(弹性染色)2021/6/2741Verhoeff氏弹力纤维染色法：操作方法：切片常规脱蜡。Verhoeff染液15-60分钟。以2%三氯化铁分化（镜下控制）。水洗再以95%酒精洗去碘。流水洗。以HE或VG氏染液复染。脱水、透明、封固。2021/6/2742【染色结果】

弹力纤维蓝黑色，其它组织视复染而定。注意事项：这种染色法染液配制简单，但对微细弹力纤维不如Weigert氏效果好。2021/6/2743试剂配制：将1克苏木素加热溶于20ml的无水酒精，冷却后，加1%三氯化铁水溶液8ml搅拌；再加入8ml的Lugoi碘液（碘1克，碘化钾2克，蒸馏水100ml）搅拌混合而成。染液仅可存放2-3周。2021/6/2744应用：1.显示皮肤组织中弹力纤维的变化2.显示鉴别心血管疾病3.显示呼吸系统和肾脏疾病时弹力纤维的变化4.对弹力纤维瘤的诊断有决定作用2021/6/2745四、Masson三色染色法

Masson三色染色法是由Mallory氏苯胺蓝菊黄G发展改良而来，但对于固定液有一定的选择性，虽然任何固定液固定后的组织可进行染色，但最好是用Zenker氏固定液或Bouin氏固定液固定组织。福尔马林固定的标本切片在染色前以3%升汞作第二次固定一小时以上，则可增强着色效果。2021/6/2746操作方法：(1)切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗；(2)Weigent氏苏木素液染核5分钟；(3)自来水洗；(4)1%盐酸分化(5)自来水洗；(6)丽春红--酸性品红溶液染5-8分钟；2021/6/2747(7)1%醋酸水溶液洗；(8)1%磷钼酸分化（1-3分钟）直到各种成分被染清晰（胶原纤维呈淡红色，肌纤维、纤维素呈鲜红色）(9)2%亮绿液染2-5分钟（或用2%苯胺蓝水溶液替代）(10)水洗（快速）(11)常规脱水、透明、封片。2021/6/2748【染色结果】

胶原纤维绿色(亮绿)（或苯胺蓝,蓝色）肌肉、纤维素红色，红细胞橘黄色，核蓝黑色。2021/6/27492021/6/27502021/6/2751试剂配制：1．丽春红-品红溶液丽春红0.7g酸性品红0.3—0.5g冰醋酸1ml蒸馏水99ml2．1%冰醋酸水溶液冰醋酸1ml蒸馏水99ml3．亮绿亮绿2.0g冰醋酸2ml蒸馏水98ml2021/6/2752第二节脂类染色法2021/6/2753脂肪和类脂（磷脂、糖脂、固醇脂等）统称为脂类。它是构成人体组织的正常成分，不溶于水而易溶于酒精、乙醚、氯仿等脂溶剂中。在化学组成上，脂类属于脂肪酸的酯或与这些酯有关的物质。脂类的主要功能是氧化供能。脂肪主要存积于脂肪组织中，并以油滴状的微粒存在脂肪细胞浆内。在病理检验中，脂类染色法最常用以证明脂肪变性，脂肪栓子以及肿瘤的鉴别。脂类染色使用最广泛的染料是苏丹染料，最常用的有苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，苏丹黑及油红O等。脂肪被染色，实际上是苏丹染料被脂肪溶解吸附而呈现染料的颜色。经研究认为组织中脂质在液态或半液态时，对苏丹染料着色效果最好。根据这一原理，适当提高温度（37℃-60℃）对组织切片染色效果是有好处的。2021/6/2754一、油红染色法：2021/6/2755试剂配制：油红O0.5g异丙醇（含量98%）100ml此为油红饱和液，可长期保存备用。2021/6/2756染色步骤：冰冻切片蒸馏水充分洗涤。油红稀释液染10-15分钟，避光、密封。油红稀释液的配制：取油红饱和液6毫升，加蒸馏水4毫升，静置5-10分钟后过滤后使用。60%乙醇镜下分化至间质清晰。水洗。Marry氏苏木素复染核。水洗。甘油或甘油明胶封片。2021/6/2757【结果】

脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色2021/6/2758注意事项：油红染色时应避免试剂挥发过多，否则易形成背景沉淀。60%乙醇分化，应于镜下控制至脂肪组织呈鲜红色，间质无色时为度。2021/6/2759二、苏丹Ⅲ(SudanⅢ)染色法2021/6/2760操作方法：固定于10%甲醛的组织。水洗后采用冰冻或石蜡切片。经蒸馏水后，浸染于Harris苏木素或明矾苏木素中淡染1-2分钟。自来水冲洗。水洗后，移入70%酒精5秒钟。投入苏丹Ⅲ染液中约30分钟或更长时间，置于56℃温箱中。在70%酒精中洗涤5-10秒钟。洗于蒸馏水中，将切片周围的水分小心擦掉。甘油明胶封固。2021/6/2761试剂配制：1.苏丹Ⅲ染液配法：将0.15克苏丹Ⅲ溶解于100ml70%酒精或纯丙酮和70%酒精混合液中（各50ml），临用时过滤，所得滤液即为饱和浓度。注：浸染时，容器必须盖好，否则酒精或丙酮挥发，染料沉淀。2.甘油明胶配制：明胶40g

蒸馏水210ml

甘油250ml

石碳酸结晶5ml先将明胶浸入蒸馏水中2小时或更长时间，然后加甘油和石碳酸，加热15分钟，摇搅直至混合液均匀为止。2021/6/2762【结果】

脂肪呈橙红色，胆脂素呈淡红色，脂肪酸不着色，细胞核呈蓝色。2021/6/27632021/6/27642021/6/2765苏丹Ⅲ2021/6/2766苏丹Ⅳ(SudanⅣ)染色法：苏丹Ⅳ又名猩红，是苏丹Ⅲ的衍生物，作为脂肪染剂，经各地实验证明，其结果优于苏丹Ⅲ。其染色步骤与苏丹Ⅲ染法完全相同，从略。2021/6/2767应用：（1）心、脑、肾等组织器官的脂肪栓塞，脂肪染色即可判定栓子是否为脂肪滴。（2）心脏、肝脏等脂肪变性：脂肪染色可显示变性细胞内的脂滴。（3）脂肪肉瘤与其它间叶组织的恶性肿瘤的鉴别：脂肪染色即可显示脂肪肉瘤瘤细胞内产生的脂滴。2021/6/2768脂肪栓塞（Fatembolism）2021/6/2769

第三节糖原和粘液染色2021/6/2770

㈠糖原的概念

糖原（glycogen）系由糖衍化而来，是单纯的多糖，正常情况下，糖原存在胞浆内，在肝脏、心肌、骨骼、肌肉含量最多。通常根据机体能量代谢将组成内的糖原分为不稳定性和稳定性两类：

不稳定性糖原正常情况下储积于肝脏和肌肉，这种糖原当身体需要能量时很容易转化为葡萄糖。

稳定性糖原仅以微量存积于身体的各种组织和细胞中，如神经、上皮、软骨细胞，以及白细胞等。2021/6/2771

糖原易溶于水，在酶的作用下很容易分解葡萄糖更易溶于水，机体死后1小时葡萄糖可转化为蔗糖，因此组织必须起新鲜时固定或冰冻起来，固定之前决不能用水或生理盐水浸洗。作为糖原染色的切片，必需经特殊固定液固定后而进行石蜡切片，才能把糖元保存下来。2021/6/2772㈡组织固定

1）为了不使糖原损失，一般用含酒精的溶液，如AAF液

2）采用低温固定，肝组织放入冰箱，使酶分解糖原慢。进行冰冻切片，可以显示糖原在细胞质内的糖元分布2021/6/2773㈢组织固定中的注意事项

1．尽可能选取小块新鲜组织及时固定。

2．多次更换乙醇固定液，在4℃左右温度内固定与保存。

3．乙醇能沉淀和糖原，但仍可溶于水。所以最好以乙醇为溶剂的混合固定液固定为佳。2021/6/2774（四）糖原染色方法

PAS法——对碘酸雪夫化反应。

它的应用较广泛，除用于糖元的鉴定和粘液的显示外，还可以观察肾小球基底膜，阿米巴滋养体的着色。

2021/6/2775

【雪夫氏试剂的配制】

①

碱性品红1g

②

1N盐酸20ml

③

偏重亚硫酸钠1g

④

活性炭2g

⑤

蒸馏水200ml

2021/6/2776【配法】

1.

蒸馏水200ml煮沸后，加入碱性品红1g，并不断摇动，使碱性品红彻底溶解（溶解液为深红色）。

2.冷却到50℃时，加入1N盐酸20ml。

3.再待冷却至35℃时加入2g偏重亚硫酸钠，盖紧胶木塞，轻轻摇动使其溶解，

4.碱性品红明显变化，然后放入冰箱内24h，溶液为淡黄或淡红色，

5.用活性炭过滤使溶液呈无色——无色品红，又称schiff氏液。贮存于棕色瓶中放入冰箱备用。2021/6/2777

【染色方法】

（1）组织切片，脱腊至水洗。

（2）蒸馏水洗。

（3）1%过碘酸氧化5--10’。

（4）充分蒸馏水洗。

（5）schiff氏液染色20’（放入暗处）。

（6）自来水洗10’。

（7）苏木素染核

（8）脱水、透明、封片

2021/6/2778【结果】糖原和PAS反应阳性物质成红色，细胞核蓝色。2021/6/27792021/6/27802021/6/2781

（五）糖原染色的应用2021/6/27821．证明与鉴别细胞内空泡状变性

用ＨＥ染色