《口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼 吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析 检测方法》

ICSXX.XXX

XXX

团体标准

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口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼

吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析

检测方法

ColloidalGoldimmunochromatographicStripfordetectionofFMDVtypeO、

ASFV、CSFV、PRRSV

（征求意见稿）

在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国兽医协会发布

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口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体

金免疫层析检测方法

1范围

本文件规定了口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析检测方

法的原理、仪器设备及耗材、操作步骤、结果判定。

本文件适用于快速检测猪血清中口蹄疫病毒O型抗体、非洲猪瘟病毒抗体、猪瘟病毒抗体、猪繁殖

与呼吸综合征病毒抗体。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

GB/19489样品处理的生物安全措施、实验室生物安全通用要求

NYT541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

GB/19489-2008生物安全实验要求

中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全管理规范

中华人民共和国主席令第五十六号《中华人民共和国生物安全法》

中华人民共和国主席令第八十七号《中华人民共和国动物防疫法》

中华人民共和国国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》

3术语和定义

胶体金颗粒：goldnanoparticles

胶体金免疫层析技术：ColloidalGoldimmunochromatographyAssay（GICA）

是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术。

4符号和缩略语

下列符号适用于本文件。

下列缩略语适用于本文件。

BSA：牛血清白蛋白。

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IgG：免疫球蛋白G。

PB：磷酸盐缓冲液。

pH：pH值。

5.1试剂

5.1.1口蹄疫O型病毒纯化抗原146S。具体制备方法如下：（1）毒种的繁殖与灭活：将

O/MYA98/JSCJ/2010细胞毒种，按维持液5%～10%的量接种生长良好的BHK-21单层细胞转瓶内，于

37℃培养8～12个小时，当达到90%以上细胞病变时，用7.5%NaHCO3溶液调pH值至7.6～7.8，加

入青霉素（100IU/mL）、链霉素（100IU/mL），病毒液用2mmol/L二乙烯亚胺在30℃下灭活24h，

加入2%硫代硫酸钠阻断，4000r/min、2-8℃离心30min，取上清（O/MYA98/JSCJ/2010灭活制苗病

毒抗原液），-20℃冻存。（2）抗原的去脂与浓缩：①-20℃保存的O/MYA98/JSCJ/2010灭活制苗病

毒抗原液10000mL按80g/L加入PEG6000和40g/L加入NaCl，充分搅拌4h，2-8℃过夜；②将步

骤（1）得到的病毒液8000r/min离心45min，弃上清；③PB缓冲液（0.2mol/LNa2HPO4,0.2mol/L

NaH2PO4，pH7.4）悬浮步骤②获得的沉淀（冰上操作），匀浆器反复研磨，至终体积100mL；④向

步骤③获得的溶液中加入2倍体积的三氯乙烯于密闭容器中，剧烈振荡充分乳化，然后2～8℃、8000

r/min离心30分钟，收集上层液；⑤将步骤④获得的上层液2～8℃、45000r/min离心180分钟，弃

上清；⑥PB缓冲液悬浮沉淀，匀浆器中研磨，至终体积6mL；⑦向步骤⑥获得的溶液中加入1%的

脱氧胆酸钠溶液，充分摇匀，2～8℃过夜，即为浓缩病毒抗原。（3）蔗糖密度梯度离心：配制50%蔗

糖母液；用50%蔗糖配制45%、35%、25%、15%四种浓度梯度蔗糖溶液；蔗糖梯度制备及离心，离心

管中先加入45%蔗糖溶液2.5mL，依次叠加35%、25%、15%蔗糖溶液2.5mL，制备6个蔗糖梯度柱，

2～8℃静止平衡过夜；次日将浓缩病毒抗原液6mL分别加入6个蔗糖梯度柱顶部（每个柱子加入1mL），

2-8℃、35000r/min离心150min。（4）抗原146S收集：离心结束后，取1管上述梯度离心纯化抗原，

自上而下吸取梯度离心抗原，每0.5mL作为1个收集级分，对收集的级分进行顺序编号，共收集22个

级分。其余5支离心管重复上述操作，并分别将同层收集级分合并至22个级分管中。用紫外分光光度

计（北京普析）测定22个级分OD259nm值，按照FMDV完整病毒粒子146S可能存在的区域分析数

值，当第15-19号收集级分出现明显吸收峰值，取该区域OD259nm大于0.4的级分合并，作为口蹄疫

O型病毒纯化抗原146S。

5.1.2非洲猪瘟病毒重组p30蛋白。制备方法如下：以GenBank数据库中非洲猪瘟病毒基因II型Georgia

2008/1株p30基因序列（Genebank号：MH910495）为表达目的基因的参考序列，利用基因合成的方法

由金斯瑞生物科技股份有限公司合成p30基因序列，并将其导入pGEMT-easy载体中，构建带有p30

基因的重组质粒pGEM-p30。利用限制性内切酶EcoRI与NotI对保存的重组质粒pGEM-p30进行双酶

切，回收p30基因目的片段，16℃过夜连接同样双酶切后回收的pET-28a载体。后转化DH5α感受态细

胞，筛选阳性菌株，提取阳性质粒。将该质粒经EcoRI与NotI双酶切验证，结果出现明显两条带且目

的片段大小约为585bp，符合预期；PCR扩增（T7通用引物对T7P：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；

T7T：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’）出大小约为884bp基因片段，符合预期，将酶切和PCR鉴

定一致的质粒进行测序鉴定，测序结果显示与非洲猪瘟病毒（ASFV）基因II型Georgia2008/1株的p30

基因序列的同源性为100%，并将测序正确的质粒命名为pET-28a-p30重组阳性质粒。将pET-28a-p30

重组阳性质粒转化至Rosetta感受态细胞中。挑取单克隆后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测

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序。将测序正确的菌液1：100加入到2×YT培养基扩大培养至OD600nm为3.0左右后，加入终浓度为

0.1mmol/L的IPTG在37℃诱导表达4h，12000r/min离心10min后收集沉淀，PBS重悬沉淀后置-80℃

冷冻，然后融化，反复冻融3次，超声破碎至液体清亮（超声条件：电压200V，工作3s，暂停3s）；

12000r/min离心10min，分别收集沉淀和上清，SDS分析蛋白的表达情况。将沉淀使用8mol/L

的尿素裂解后经3mol/L盐酸胍复性，使用Ni柱法进行纯化。纯化方法为：分别用终浓度为20mmol/L

和50mmol/L的咪唑洗脱杂蛋白3次，每次10mL，然后使用200mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白。

5.1.3口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析试纸条，按照附

录A.1制备。

5.1.4相关试剂配制按照附录B.1配制。

6仪器设备及耗材

6.1三维划膜喷金仪

6.2数控高速斩切机

6.3隔水式恒温培养箱

6.4磁力搅拌器

6.5硝酸纤维素膜

6.6玻璃纤维纸

6.7吸水纸

6.8PVC背衬板

6.9试纸卡壳

6.10微量可调移液器（10μL、50μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）

7技术原理

本联检试纸卡采用胶体金免疫层析方法和直接法试验原理，检测口蹄疫病毒、非洲猪瘟病毒、猪瘟

病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒四种病毒病抗体。通过样本与免疫胶体金标记物沿层析膜移动，样本中

口蹄疫病毒、非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒四种病毒病抗体分别与四种免疫胶体

金标记物、检测线（T线）上的抗原结合而显色，免疫胶体金标记物继续移动与质控线（C线）上的抗

体结合显色。若某病毒对应的观测窗里的质控线与检测线均显色，则该待测样本含有该病毒抗体；若某

病毒对应的观测窗里的质控线显色且检测线不显色，则该待测样本不含有该病毒抗体。

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8样品采集及保存

样品采集按照NY/T541进行。无菌注射器静脉采血，不少于2mL，用自然析出法分离血清后，置

于无菌血清管中，若在一周内检测，可置2℃~8℃条件下保存，若超过一周检测，应置于-20℃以下

冷冻保存。

血清样本运输时应注意2-8℃冷藏。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安

全标识。

9样品检测

将联检试纸卡从2～8℃取出，平衡到室温（25℃左右），拆除试纸卡外包铝箔袋，将卡平放在桌面

上。用移液器吸取血清样本，分别向样品孔中各加入30μL，之后再分别向样品孔中各滴加30μL扩展液。

10min内，结果将会出现在观测框内。实验结束后，将使用过的试纸条、移液器吸头与被检样品应作无

害化处理。

10试验成立条件

试纸条质控线显色，试验成立，结果有效；试纸条质控线不显色，试验不成立，结果无效。

11结果判定（参考附录A）

观察各个观测窗内检测线色带有无，按照附图2和如下原则分别进行判定。判定标准如下：被检

血清样品质控线与检测线都出现清晰可见红色条带，判定为阳性；被检血清样品仅质控线出现清晰

可见红色条带，检测线不显色，判定为阴性。

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附录A

(规范性)

A.1口蹄疫O型病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备

A.1.1胶体金溶液制备：取1%氯金酸水溶液1mL加99mL蒸馏水制成0.01％氯金酸水溶液，加热至沸

腾，加入不同1.5mL质量百分比浓度为1％柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，直至液体变为酒红色，冷却

备用。

A.1.2.免疫胶体金（1）的制备：用0.02MK2CO3溶液调节pH值至7.5，按1.1μg/mL最佳标记量加入

口蹄疫O型病毒纯化抗原146S，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。

10000r/min离心40min，弃上清，将沉淀用金胶缓冲液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗

糖，5%BSA)悬浮溶解，备用。

免疫胶体金（2）的制备：用0.02MK2CO3溶液调节pH值至8.5，按4μg/mL最佳标记量加入兔抗

IgG，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。10000r/min离心40min，

弃上清，将沉淀用金胶缓冲液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗糖，5%BSA)悬浮溶解。将

免疫胶体金（1）与（2）以固定比例混合，涂覆玻璃纤维膜。

A.1.3上述口蹄疫O型病毒免疫胶体金溶液喷涂到长270mm、宽10mm的玻璃纤维垫(Ahlstrom公司)

上，37℃下干燥0.5h，得到免疫胶体金探针垫。

A.1.4含有质控线（C线）和检测线（T线）的硝酸纤维素膜的制备：将口蹄疫O型病毒纯化抗原146S

调整至0.2mg/mL，羊抗兔抗体调整至0.2mg/mL的工作浓度，分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测

带与质控带，37℃干燥0.5h，保存备用。

A.1.5.试纸的组装：在底衬，一般采用PVC材料，上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆有免疫胶体金

的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸，按照要求切割成3.98mm宽度的试纸，即制成口蹄疫O型

病毒抗体胶体金免疫层析试纸。

A.2非洲猪瘟病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备

A.2.1胶体金溶液制备：取1%氯金酸水溶液1mL加99mL蒸馏水制成0.01％氯金酸水溶液，加热至沸

腾，加入不同1.5mL质量百分比浓度为1％柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，直至液体变为酒红色，冷却

备用。

A.2.2免疫胶体金（1）的制备：用0.02MK2CO3溶液调节pH值至9.0，按2.7μg/mL最佳标记量加入

非洲猪瘟病毒重组p30蛋白，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。

10000r/min离心40min，弃上清，将沉淀用金胶缓冲液(pH7.5含10mMPB,0.25%Tween-20,10%蔗糖,

5%BSA)悬浮溶解，备用。

免疫胶体金（2）的制备：用0.02MK2CO3溶液调节pH值至8.5，按4μg/mL最佳标记量加入兔抗

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IgG，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。10000r/min离心40min，

弃上清，将沉淀用金胶缓冲液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗糖，5%BSA)悬浮溶解。将

免疫胶体金（1）与（2）以固定比例混合，涂覆玻璃纤维膜。

A.2.3上述非洲猪瘟病毒免疫胶体金溶液喷涂到长270mm、宽10mm的玻璃纤维垫(Ahlstrom公司)上，

37℃下干燥0.5h，得到免疫胶体金探针垫。

A.2.4含有质控线（C线）和检测线（T线）的硝酸纤维素膜的制备：将非洲猪瘟病毒重组p30蛋白调

整至0.1mg/mL，羊抗兔抗体调整至0.2mg/mL的工作浓度，分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测带

与质控带，37℃干燥0.5h，保存备用。

A.2.5试纸的组装：在底衬1（一般采用PVC材料）上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆有免疫胶体金

的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸，按照要求切割成3.98mm宽度的试纸，即制成非洲猪瘟病

毒抗体胶体金免疫层析试纸。

A.3猪瘟病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备

A.3.1胶体金溶液制备：取1%氯金酸水溶液1mL加99mL蒸馏水制成0.01％氯金酸水溶液，加热至沸

腾，加入不同1.5mL质量百分比浓度为1％柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，直至液体变为酒红色，冷却

备用。

A.3.2免疫胶体金（1）的制备：用0.02MK2CO3溶液调节pH值至7.5，按34μg/mL最佳标记量加入猪

瘟病毒重组E2蛋白，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。10000r/min

离心40min，弃上清，将沉淀用金胶缓冲液(pH7.5含10mMPB,0.25%Tween-20,10%蔗糖,5%BSA)悬

浮溶解，备用。

免疫胶体金（2）的制备：用0.02MK2CO3溶液调节pH值至8.5，按4μg/mL最佳标记量加入兔抗

IgG，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。10000r/min离心40min，

弃上清，将沉淀用金胶缓冲液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗糖，5%BSA)悬浮溶解。将

免疫胶体金（1）与（2）以固定比例混合，涂覆玻璃纤维膜。

A.3.3上述猪瘟病毒免疫胶体金溶液喷涂到长270mm、宽10mm的玻璃纤维垫(Ahlstrom公司)上，37℃

下干燥0.5h，得到免疫胶体金探针垫。

A.3.4含有质控线（C线）和检测线（T线）的硝酸纤维素膜的制备：将猪瘟病毒重组E2蛋白调整至

0.57mg/mL，羊抗兔抗体调整至0.2mg/mL的工作浓度，分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测带与质

控带，37℃干燥0.5h，保存备用。

A.3.5试纸的组装：在底衬（一般采用PVC材料）上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆有免疫胶体金

的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸，按照要求切割成3.98mm宽度的试纸，即制成猪瘟病毒抗

体胶体金免疫层析试纸。

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A.4猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备

A.4.1胶体金溶液制备：取1%氯金酸水溶液1mL加99mL蒸馏水制成0.01％氯金酸水溶液，加热至沸

腾，加入不同1.5mL质量百分比浓度为1％柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，直至液体变为酒红色，冷却

备用。

A.4.2免疫胶体金（1）的制备：用0.02MK2CO3溶液调节pH值至7.5，按4μg/mL最佳标记量加入猪

繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。

10000r/min离心40min，弃上清，将沉淀用金胶缓冲液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗

糖，5%BSA)悬浮溶解，备用。

免疫胶体金（2）的制备：用0.02MK2CO3溶液调节pH值至8.5，按4μg/mL最佳标记量加入兔抗

IgG，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。10000r/min离心40min，

弃上清，将沉淀用金胶缓冲液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗糖，5%BSA)悬浮溶解。将

免疫胶体金（1）与（2）以固定比例混合，涂覆玻璃纤维膜。

A.4.3上述猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫胶体金溶液喷涂到长270mm、宽10mm的玻璃纤维垫

(Ahlstrom公司)上，37℃下干燥0.5h，得到免疫胶体金探针垫。

A.4.4含有质控线（C线）和检测线（T线）的硝酸纤维素膜的制备：将猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋

白调整至0.42mg/mL，羊抗兔抗体调整至0.2mg/mL的工作浓度，分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成

检测带与质控带，37℃干燥0.5h，保存备用。

A.4.5试纸的组装：在底衬（一般采用PVC材料）上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆有免疫胶体金

的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸，按照要求切割成3.98mm宽度的试纸，即制成猪繁殖与呼

吸综合征病毒抗体胶体金免疫层析试纸。

A.5口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫试纸条的制备

将A1～4制备的试纸条装入一个壳体中，再加干燥剂后密封单包装保存。

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附图