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文档简介
CAR-T治疗的幕后英雄:慢病毒载体培养及纯化前
言慢病毒载体使得真核细胞基因修饰、表达变得更简单,在实验室研究、工业生产和临床治疗中应用越来越广泛。比如第三代自灭活慢病毒载体用于造血干细胞的基因修饰,治疗原发性免疫缺陷和血红蛋白病。慢病毒载体作为CAR转导T细胞的载体,是CAR-T细胞生产过程中的关键原料,对实现大规模生产、缩短生产周期具有重要意义。01慢病毒载体和CAR-T慢病毒载体是一种源于人类免疫缺陷病毒(HIV)的基因载体。在构建慢病毒载体时,为了避免产生有复制能力的病毒,会把HIV-1基因组分装与不同的质粒中,再共转染细胞,获得只有一次感染能力而无复制能力的慢病毒载体。目前慢病毒载体已从两质粒系统发展到四质粒系统,安全性不断提高。目前常用的是四质粒系统,有更广泛的应用,比如基因编辑、基因治疗、转基因动物、药物研究、CAR-T细胞治疗等。慢病毒载体有更广泛的宿主,能够感染分裂和非分裂细胞。对于难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能极大的提高目的基因的转导效率。慢病毒可以将外源基因有效的整合到细胞染色体中,在靶细胞中获得持续高效稳定的表达。慢病毒载体还可以携带5kb以上的目的基因,将cDNA克隆到慢病毒载体中。慢病毒载体的生产和用途示意图(源自参考文献)CAR-T细胞治疗在多种癌症的临床上取得成功,是目前医学研究前沿热门的方向之一。CAR-T生产制备流程主要包括T细胞富集、分化、扩增,通过病毒或非病毒载体进行CAR基因转移,然后再进行体外CAR-T细胞扩增,最终制成细胞产品。因此将特定的CAR基因转导进入T细胞的病毒载体是整个生产过程的关键原料。目前大部分CAR-T细胞的制备使用慢病毒载体,如诺华的Kymriah和Juno的Breyanzi,依靠慢病毒载体完成CAR-T细胞制造。CAR-T细胞治疗示意图(源自参考文献)02慢病毒载体生产制备慢病毒载体作为CAR-T的核心环节,其质量对细胞产品及其治疗效果具有直接影响。虽然生产慢病毒载体的步骤并不复杂,但如何大规模生产符合cGMP要求的高质量慢病毒载体仍具有挑战性。慢病毒的生产是一个持续几天的细胞培养过程,将病毒载体转移到培养基中。主要有贴壁和悬浮两种培养方式。小规模研究可以选择贴壁培养,但大规模生产需要悬浮培养。慢病毒的大规模生产常用HEK293T细胞系,可以在没有贴壁的情况下迅速悬浮生长。将包装细胞在培养基中传代数次,达到一定数量后,用病毒包装质粒和目的基因载体质粒共转染细胞。在几天的培养过程中,包装细胞会产生大量慢病毒颗粒,可以从培养基中收获。病毒载体纯化可使用多种方法,例如梯度纯化法或色谱法。除了细胞系,慢病毒的悬浮无血清培养已逐步替代传统的贴壁培养模式。悬浮培养能够降低成本和污染风险,培养及纯化步骤更简单,更容易放大。在成本方面,培养基是不可忽略的因素,选择来源和化学成分明确、不含血清的培养基,会极大的降低成本和简化下游纯化工艺,并降低污染风险。义翘神州已成功开发多款适用于HEK293细胞悬浮培养的无血清培养基,属于无血清、无抗生素、无动物源性组分的即用型培养基,可用于慢病毒载体大规模悬浮培养。大规模生产还需要考虑杂质去除,比如宿主DNA,在200L的反应器中需要750mg的质粒DNA,意味着转染过程中会有大量的残留,因此需要选择合适的核酸酶进行去除。总的来说,理化性质不稳定,回收率低,培养体系和纯化工艺等未攻克的问题,依旧是慢病毒规模化生产的瓶颈和关键。义翘神州慢病毒载体包装相关产品义翘神州可以提供慢病毒包装的关键原材料如Sinofection®转染试剂、无血清HEK293培养基和质粒生产,以及慢病毒纯化工艺过程中用于去除宿主核酸的GMP级核酸酶等。另外,我们也可提供全面的HEK293细胞库检定服务,充分保障CAR-T药物的安全性。无血清细胞培养基及补料液新品推荐,欢迎咨询SMM293-CD1培养基(货号:M293CD1)相同条件下,使用SMM293-CD1培养基,HEK293F细胞密度更好。其他无血清、无动物源的HEK293培养基货号名称应用M293TIISMM293-TII培养基新一代产品,HEK293细胞悬浮培养、蛋白瞬时表达、慢病毒包装M293TISMM293-TI培养基原代产品,HEK293细胞悬浮培养、蛋白瞬时表达、慢病毒包装细胞转染试剂义翘神州拥有高品质的转染试剂Sinofection®TransfectionReagent(Cat#:STF02),细胞毒性小、重复性高,可用于慢病毒载体的高效转染,转染效率基本可以达到95%以上。GMP级核酸酶义翘神州提供GMP级条件下生产的全能核酸酶SuperNuclease(Cat#:GMP-SSNP01),无动物源性,可高效降解单链、双链、线性、环状、超螺旋等任何形式的DNA及RNA。超高活性,应用场景广泛且使用量低不易残留,质量、性能、供货能力可靠,并已完成在FDA的药物主文件申报备案(DMF号:35978),满足药物申报的需求。相同条件下,不同用量的GMP级全能核酸酶和其他品牌核酸酶对鲑鱼精DNA的降解效率相当细胞库检测义翘神州遵循NMPA、FDA、EMA、ICH等多个国内外法规和指导原则,建立了全面的细胞库测定方法,助力于CAR-T细胞治疗的安全性,主要包括以下几个检测方面:无菌检查、支原体检查、内外源病毒污染检查、成瘤性检查等。慢病毒包装质粒生产义翘神州升级改造后的慢病毒质粒制备平台,采用GMP级别的生产线,对过程和最终产品的严格管控,确保了最终产品质量符合客户需求。义翘神州可以提供从μg级别、mg级别至g级别不同规模的科研级质粒生产服务,满足不同的需求。参考文献:1.XiaoyuWang,etal.Recentadvancesinlentiviralvectorsforgenetherapy.2.NataliaElizaldeandJuanCarlosRamírez.Lentiviralvectors:keychallengesandnewdevelopments.3.MichaelC.MiloneandUnaO’Doherty.Clinicaluseoflentiviralvectors.4.DavidEscors,KarineBreckpot.Lentiviralvectorsingenetherapy:theircurrentstatusandfuture
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