DB5101T 52-2019 鲑科鱼类传染性造血器官坏死病毒逆转录-聚合酶链式反应检测方法　　

B50/59DB5101成都市市场监督管理局发布IDB5101/T52-2019前言 12规范性引用文件 13试剂和耗材 14仪器和设备 2 36结果判定 4附录A（规范性附录）试剂配制 5附录B（资料性附录）IHNV的G基因的全序列（1527bp） 6DB5101/T52-2019本标准编写按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由成都市农业农村局提出。本标准主要起草单位：成都市农林科学院、成都市动物疫病预防控制中心、四川农业大学。本规程主要起草人：魏文燕、汪开毓、李良玉、杨马、刘家星、唐洪、苏中海、杨倩、刘韬、李敏、朱玲、周潇潇、李俐睿、何洁、杨壮志、陈健、陈霞、邓钰。1DB5101/T52-2019鲑科鱼类传染性造血器官坏死病毒逆转录-聚合酶链式反应检测方法本标准规定了鲑科鱼类传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测的试剂耗材、仪器设备、IHNV的PCR鉴定和结果判定。本标准适用于成都市行政区域范围内鲑科鱼类IHNV的检测鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水国家标准GB/T18088-2000出入境动物检疫采样3试剂和耗材3.1IHNV参考毒株G基因序列参考NCBI上公布的IHNV的G基因全长参考序列（登录号为：NC_001652）。3.2水实验用水应符合GB/T6682-2008，一级，并用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，除去DNA酶和RNA酶。3.3Taq酶-20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。3.4dNTP-20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化，浓度为10mmol/L。3.5逆转录酶AMV活力单位：40U/μL；-20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。3.6RNA酶抑制剂（Ranase）活力单位：40U/μL；-20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。2DB5101/T52-20193.7.1所选取的基因编码IHNV的糖蛋白（G基因采用一对特异性引物，扩增目标片段全长1527bp，浓度为40μmol/L。3.7.2上游引物F：5’-ATGGACACCATGATCACCACTCC-3’；3.7.3下游引物R：5’-TTAGGACCGGTTTGCCAGGTGATAC-3’。3.8无水乙醇分析纯，使用前预冷到-20℃。3.9矿物油分析纯。3.10溴酚蓝3.11Trizol4℃保存。4仪器和设备4.1PCR扩增仪。样品台温度范围：0℃~105℃;4℃保温；温度精度：设定温度±0.5℃;梯度范围：30℃~100℃;温度均匀性：±0.5℃（孔间温度差），在30秒内达到目标温度；温度差异范围：1℃~25℃。4.2电泳仪。输出范围：0V~250V；最大功率：250W；与水平电泳槽相容；适用1%或3%琼脂糖；适用TBE或TAE缓冲液；带或不带溴化乙锭。4.3紫外透射仪。紫外波长：302nm；暗箱式。4.4普通冰箱。冷冻工作温度：-20℃;冷藏工作温度：4℃。4.5超低温冰箱。工作温度：-70℃~-80℃。4.6台式离心机。转速范围200rpm~12000rpm；最大离心力12000(×g转速精度：±50r/min；温度设置范围：-10℃~40℃。~4.7电子天平。量程：≤120g；分度值：0.001g。4.8低温高速离心机。3DB5101/T52-2019最高转速：≥12000rpm；最大离心力：≥12000(×g）；温度控制范围：-40℃~30℃。4.9微量移液器及吸头。规格分别为：1000μL，200μL，10μL；吸头需无酶化处理。4.10恒温空气摇床。温度范围：4℃~40℃;控温精度：0.1℃;工作环境温度：10℃~30℃;定时范围：0h~999.9h；转速范围：30rpm~200rpm。4.11其它耗材剪刀，镊子（高压灭菌处理）；离心管和PCR管（高压灭菌处理）；组织研磨器（高压灭菌处理）。5.1采样5.1.1在生物安全柜中，无菌条件下进行采样过程。所有采集样品均需留样备检。——鱼卵：取卵膜，100mg~200mg；——性成熟亲鱼：取卵巢液和精液，20μL~50μL——体长≤4cm的鱼苗：取整条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊，取样≥50mg；——体长4cm~6cm的鱼苗：取所有内脏，取样≥50mg；——体长大于6cm的鱼：分别取肝、体肾、脾、头肾，取样≥50mg；——无症状的鱼：分别取肝、体肾、脾、头肾，取样≥50mg。5.1.2各组织样品独立于-70℃~-80℃保存备用。5.2样品处理在生物安全柜中，无菌条件下进行样品处理过程。组织样品放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，重复三次。研磨产物放入离心管中，再向离心管中按50mg/mL~100mg/mL加入Trizol（组织体积不能超过Trizol体积的10%），室温放置5min，使其充分裂解（此时可放-70℃长期保存）。5.3RNA抽提对裂解液12000r/min离心5min，弃沉淀。按200μL氯仿/mLTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4℃12000r/min离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。按0.5mL异丙醇/mLTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5min~10min。4℃12000(×g）离心10min，弃上清，RNA沉于管底。按1mL75%乙醇/mLTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃8000(×g）离心5min，尽量弃上清。室温晾干或真空干燥5min~10min。用50μL水溶解RNA样品，55℃~60℃,5min~10min。得到样品可作RT-PCR模板。5.4一步法RT-PCR扩增目的基因RNA模板5μL；5倍浓缩RT-PCR缓冲液10μL；dNTP混合物1μL；F引物和R引物各1μL；AMV反转录酶1μL（见附录A.2）；MgCl22μL（见附录A.3）；TaqDNA聚合酶1uL；RNA酶抑制剂1μL；DEPC处理4DB5101/T52-2019的水至终体积50μL。PCR参数设定：45℃30min；94℃3min预变性；94℃30s变性，60℃30s复性退火，72℃1min30s延伸，30个循环；72℃10min终末延伸；4℃保温。5.5琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液（见附录A.4）配制1%的琼脂糖平板（见附录A.5）。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶孔。5μL样品和2μL样品缓冲液（见附录A.6）混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子质量作参照。120V电泳约25min。当溴酚蓝到达四分之三胶带时停止电泳。在紫外光照射下观察有无DNA条带。5.6设立对照在样品处理过程中应设立阳性对照（已知IHNV的RNA）、阴性对照（无病毒携带的健康鱼组织）和空白对照（等体积水）。6结果判定经PCR后阳性对照会出现一条1527bp的DNA带。阴性对照和空白对照没有该核酸带。待测样品PCR扩增后未出现任何条带则应判为阴性。待测样品PCR扩增后能在相应1527bp的DNA位置上出现条带且将PCR产物送检测序后，和已知DNA片段（见附录B）的序列吻合度≥99%应判定为阳性。待测样品PCR扩增后的条带未处于1527bp的DNA位置上或经测序后的序列吻合度≤99%，则需重复检测以验证。5DB5101/T52-2019（规范性附录） 试剂配制A.1纯度要求标准中所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。A.2逆转录酶AMV的5倍浓缩缓冲液——Tris-HCl250mmoL/L，pH8.3；——氯化钾（KCl）250mmoL/L；——氯化镁（MgCl2）50mmoL/L；——DTT50mmoL/L。A.3氯化镁溶液浓度为25mmol/L。A.4TBE电泳5倍浓缩缓冲液——Tris——硼酸（HBO3）——EDTA——水54g；27.5g；——用5mol/L的盐酸（HCl）调pH到8.0。A.5EB（ethidiumbromide，核酸染色剂）用水配置成10mg/mL的浓缩液。用时每10mL电泳液或琼脂中加1μL。A.6样品缓冲液每100mL水溶液中含：溴酚蓝0.25g。6DB5101/T52-2019（资料性附录）IHNV的G基因的全序列（1527bp）B.1IHNV的G基因全序列如下：ATGGACACCATGATCACCACTCCGCTCATTCTCATTCTGATCACCTGCGGAGCAAACAGCCAAACCGTCAAACCCGACACCGCAAGCGAATCAGACCAACCCACCTGGTCAAACCCGCTCTTCACCTATCCCGAGGGATGCACTCTGGACAAGCTCTCTAAGGTCAATGCCTCTCAACTGAGATGCCCAAGGATCTTCGACGATGAGAACAGGGGGCTAATTGCCTATCCCACATCCATCCGGTCCCTGTCAGTCGGAAACGACCTCGGGGACATTCACACCCAAGGGAACCACATCCACAAAGTCCTGTACCGCACAATCTGCTCAACAGGGTTCTTCGGGGGTCAGACGATAGAGAAGGCGCTTGTAAAAATGAAACTCTCTACGAAAGAAGCAGGGGCGTATGACACCACAACCGCAGCCGCTCTGTACTTCCCAGCTCCCCGATGCCAATGGTACACCGACAACGTACAAAACGATCTCATCTTCTACTACACAACACAAAAGAGTGTTCTTAGAGATCCCTACACCAGAGACTTTCTGGACTCAGATTTTATTGGAGGAAAATGTACCAAATCACCCTGCCAGACTCATTGGTCCAACGTAGTTTGGATGGGTGATGCAGGGATACCAGCCTGTGATTCCAGCCAAGAGATAAAAGCTCACCTCTTTGTTGATAAAATCTCCAATCGAGTCGTGAAGGCAACGAGCTACGGACACCACCCCTGGGGACTGCATCAGGCCTGTATGATTGAATTCTGTGGGCAACAGTGGATACGGACAGATCTCGGTGACCTAATATCTGTCGTATACAATTCTGGATCAGAAATCCTCTCGTTCCCGAAGTGTGAAGACAAGACCGTGGGAATGAGGGGAAACTTGGATGACTTTGCCTATCTAGACGATCTGGTGAAGGCCTCTGAGAGCAGAGAGGAATGTCTTGAGGCGCACGCCGAGATAATATCAACAAACAGTGTGACTCCATACCTCCTATCCAAATTCCGATCTCCACATCCCGGAATAAATGACGTCTACGCTATGCACAAAGGCTCCATCTATCACGGGATGTGCATGACGGTCGCTGTGGACGAGGTATCCAAGGACAGGACAACGTACAGGGCCCATCGCGCTACCAGCTTCACGAAATGGGAACGACCCTTTGGGGATGAGTGGGAGGGCTTTCACGGATTGCACGGAAACAACACCACCATTATTCCAGACCTGGAGAAATACGTCGCCCAGTACAAGATGAGCATGATGGA