生物发酵工程1（含答案解析）

生物发酵工程1

试卷副标题

考试范围：XXX；考试时间：100分钟；命题人：XXX

注意事项：

1.答题前填写好自己的姓名、班级、考号等信息

2.请将答案正确填写在答题卡上

第I卷（选择题）

请点击修改第I卷的文字说明

第H卷（非选择题）

请点击修改第II卷的文字说明

一、综合题

1.（2021•江苏南通•）家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。巢式PCR

扩增反应在两次PCR反应中使用两组不同引物，先使用外引物对目标区域DNA片段

进行第一次PCR扩增，产生中间产物，然后使用内引物对中间产物进行第二次PCR

扩增，产生目标产物。下图是式PCR工作原理示意图，请回答：

模板：

,］使用外引物诟示次PCR扩增

中间产物

,便用内引脑进行［二次PCR扩增

目标产物-----；

‘巢式PCR工作原理示意图’

（1）巢式PCR反应体系中需要加入模板、、、引物、Mg2+、缓冲

液等。

（2）相比于常规PCR获得的产物而言，巢式PCR获得的产物特异性_______,原因

是如果利用外引物扩增产生了错误片段，再利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对

并扩增的概率o

（3）巢式PCR通常在一个试管中进行第一阶段反应，然后将中间产物等转移到第二

试管中进行第二阶段反应，不在同一试管完成的主要原因是o

（4）科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上雄性决定基因（SRY）和

常染色体上的酪蛋白基因（CSN1S1）,进行早期胚胎的性别鉴定，并将鉴定后的胚胎

进行移植。下表是主要实验步骤，请完成下表：

实验目的方法步骤要点

胚胎样品DNA提取选取囊胚的①_______细胞提取DNA

PCR引物的设计和合根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成②_____一对引

成物

PCR过程预变性->③.T退火T延伸

观察扩增结果电泳分析

受体牛④_______处理对受体牛注射前列腺素

胚胎移植将筛选出的胚胎移植到受体牛的子宫内

（5）电泳结果如下图所示,1~5号为取自不同胚胎的DNA样品进行巢式PCR的产物。

A和B条带中代表CSN1S1的是。可以确定1-5号中号胚胎为雌性。

（6）牛胚胎性别的鉴定除了可以利用PCR夕卜，下列方法也可行的有o

①差速离心法

②核酸探针杂交法

③染色体核型分析法

④抗血清免疫学法（H・Y抗原编码基因位于Y染色体上）

【答案】

（1）TaqDNA聚合酶dNTP

（2）更强升高

（3）防止引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染

（4）滋养层2变性同期发情

（5）A1,2,4

（6）②③@

【分析】

PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，所利

用的原理为DNA分子的复制，因此PCR技术一般用于基因扩增。PCR技术：①概念：

PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；②原

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理：DNA复制；③条件：模板DNA、四种脱氧核甘酸、一对引物、热稳定DNA聚合

酶(Taq酶)；④方式：以指数的方式扩增，即约2%⑤过程：高温变性、低温复性、

中温延伸。

(1)

PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA与引

物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA

聚合醐、dNTP(原料)、模板DNA、Mg2\

(2)

巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片断，第二对引物的

功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片断。第一轮扩增中，外引物

用以产生扩增产物,此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，

获得的产物特异性更强。利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率提高。

(3)

巢式PCR两次扩增所用的引物是不同的，因此两个阶段反应不在同一试管完成的主要

原因是防止引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。

(4)

对胚胎进行性别鉴定时，宜取囊胚期的滋养层细胞进行鉴定。本实验用巢式PCR技术，

用的是两轮PCR,因此需要设计2对引物。PCR过程一般是预变性—变性-退火一延

伸。在胚胎移植前需要对受体牛进行同期发情处理，便于移植。

(5)

题中利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上

的酩蛋白基因(CSN1S1)进行电泳，雌性个体没有SRY,只有一条节，雄性有两条带，

因此I,2,4是雌性，3,5是雄性，雌性和雄性共有的是常染色体上的酪蛋白基因

(CSN1S1),因此A是CSN1SI,B是SRY。

(6)

①差速离心法是分离各种细胞器的方法，不能性别鉴定；②核酸探针杂交法，Y染色体

上雄性决定基因(SRY)制成探针可以鉴定性别；③染色体核型分圻法，XY染色体形

态不同，因此也可以进行性别鉴定；④H-Y抗血清免疫学法(H-Y抗原编码基因位于Y

染色体上)，也可以性别鉴定。困此可行的是②®④。

【点睛】

本题主要考查PCR技术、胚胎分割移植的相关知识，要求考生识记PCR技术的条件；

识记胚胎分割的特点及注意事项，能结合图中信息答题，属于考纲识记和理解层次的考

查。

2.（2021•全国高三专题练习）葡萄糖异构酶经固定化后，可用于工业化生产高果糖浆。

请回答下列问题。

（1）筛选产乳糖酶的微生物时，宜用__________作为培养基中的唯一碳源。培养基中琼

脂的作用是作为___________剂。从功能上讲这种培养基属于。培养产乳糖酶的

微生物前对培养皿进行灭菌宜采用方法。

（2）戊二醛是一种化学交联剂，能与葡萄糖异构酶通过化学键交联。将酶液、戊二醛溶

液先后加入到海藻酸钠溶液中搅拌均匀，用注射器将混合液注入到溶液中

可得到凝胶珠粒，此过程所用的固化酶方法为o

（3）1个葡萄糖异构酶活力单位常定义为每分钟产生lnmol所需的酶量。下

图是温度对葡萄糖异构酶的固化酶和游离酶活力的影响曲线，该曲线表明固化酶和游离

酶的最适温度___________（从“相同”或“不同”选填）；低于或高于最适温度时，固化酶

的酶活力（从“低于”、“等于”或“高于”选填）游离酶。

（4）在用葡萄糖异构酶凝胶反应柱生产高果糖浆时，若糖液在1次流经反应柱后果糖的

浓度低于产品标准，对此你提出的改进方案是（答出2点）

【答案】乳糖凝固选择培养基干热灭菌CaCl2包埋法、化学结合

法果糖相同高于增加葡萄糖异构酶凝胶的装载量（或凝胶柱高）；降

低糖液流速；将流出液再次加入反应柱；更换直径较细的柱筒等

【分析】

1、固定化筋（固定化细胞）技术是指将酶或细胞固定于载体上，便于与反应物分离，

并能可重复使用，提高生成物的质量；

2、固定化酶一般采用化学结合法，固定化细胞多采用包埋法、物理吸附法（像用海藻

酸钠进行包埋）。

【详解】

（1）产乳糖酶的微生物能够水解乳糖为葡萄糖和半乳糖，为自身代谢提供能源，因此

要筛选产乳糖酶的微生物，应使用乳糖为唯一的碳源。制作培养基时使用琼脂作为凝固

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剂，制作液体培养基时不需要添加琼脂。能够筛选微生物细胞的培养基属于选择培养基,

培养产乳糖酶的微生物前对培养皿进行灭菌宜采用干热灭菌。

(2)戊二醛是一种化学交联剂，能与葡萄糖异构酶通过化学键交联。将酶液、戊二醛溶液

先后加入到海藻酸钠溶液中搅拦均匀，用注射器将混合液注入到CaCL溶液中可得到凝

胶珠粒，此过程所用的固化酶方法为包埋法、化学结合法。

(3)高果糖浆生产需要的酶是葡萄糖异构酹，1个葡萄糖异构酶活力单位常定义为每

分钟产生lMmol果糖所需的醐量。通过分析温度对相对酶活力影响的曲线图，固化酶和

游离酶的最适温度相同，均对应横坐标上同一点。低于或高于最适温度时，固化酶的酶

活力高于游离酶。

(4)在用匍萄糖异构酶凝胶反应柱生产高果糖浆时，若糖液在1次流经反应柱后果糖

的浓度低于产品标准，对此改进方案是增加葡萄糖异构酶凝胶的装载量(或凝胶柱高)；

降低糖液流速；将流出液再次加入反应柱；更换直径较细的柱筒等。

【点睛】

识记固定化技术，能正确判断固定化酶或固定化细胞所采用的固定化技术，再根据题干

要求作出准确的判断。

3.(2017•江苏全国•)下面是提取橘皮芳香油的装置示意图，请回答有关问题：

(1)图中表示用________法提取橘皮芳香油，采用此法的原理是o

⑵除了上述方法之外，还可以用________________法(举两例)。

⑶在加热瓶口安装冷凝管的作用是,出水口在进水口上端的原因是

(4)用锥形瓶收集到的物质是所需要的芳香油吗？,原因是o

【答案】水蒸气蒸储橘皮中的芳香油有较强的挥发性，随着水蒸气蒸储，而成分不

被破坏旋转蒸发器法和压榨起到冷凝的效果减小水和蒸气之间的温差，防

止冷凝管骤冷破裂不是是油水混合物，油轻水重，需要分离才能得到芳香油

【详解】

试题分析：根据植物原料的特点，植物芳香油的提取方法有蒸储、压榨和萃取等；水蒸

气蒸储的原理是利用水蒸气将挥发性较强的芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后,

混合物又重新分出油层和水层，分为水上蒸储、水中蒸镭和水汽蒸储；橘皮芳香油具有

挥发性，且沸点低于水的沸点，可用蒸慵法提取。

（1）图中装置表示用水蒸气蒸血法提取橘皮芳香油，在加热条件下，蒸气将橘皮中的

芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分为油层和水层。

（2）提取橘皮中的芳香油有三种方法：水蒸气蒸储法、旋转蒸发器法、压榨法。

（3）冷凝管内水的温度较低，而蒸气的温度较高，当蒸气经过时起到冷凝作用；出水

口在进水口上端，水流速度较慢,可以减小水和蒸气之间的温差，防止冷凝管骤冷破裂。

（4）用锥形瓶收集到的物质是油水混合物，油水的密度不同，静置后油便浮于水的表

面，需要用分液漏斗分离，才能得到所需要的芳香油。

4.（2020•杭州新东方进修学校高二月考）回答下列（一）（二）小题：

（一）回答与利用猿猴桃进行食品发酵有关的问题：

（1）制备舜猴桃汁。将狒猴桃清洗、消毒、破碎，制成匀浆。利月期猴桃直接制成的

领猴桃汁较为浑浊，加入__________之后，会出现絮状物，说明含有较多的果胶。为

获得无色澄清的果汁，需要首先进行脱色处理，然后再加入,将果胶分

解为半乳糖醛酸。

（2）制备狒猴桃酒。将获得的称猴桃汁置于90℃环境中处理15

分钟，以减少其他杂菌干扰。制作出的果汁，加入活化的酵母悬液，再加入

发酵，可以用来制作酒精含量较高、含糖量也高的骈猴桃酒。由

于维生素C与2,4・二硝基苯脱作用可形成红色产物，采用光电比色法测定猫猴桃酒中

维C的含量时，应先制作以为横坐标、以为

纵坐标的标准曲线。

（3）制备舜猴桃醋。将狮猴桃酒用蒸储水进行稀释，然后接种醋杆菌进行发酵。稀释

的原因是，果醋发酵与果酒发酵条件上的不同之处有

____________________•（答两点）

（-）胚胎干细胞在转基因动物方面具有定向整合、易于筛选等优点。回答下列胚胎干

细胞培养及利用的相关问题。

（1）将获取的囊胚放在培养液中培养至内细胞团突出__________________外，剥离内

细胞团并用酶消化成单个细胞,继续培养胚胎干细胞至一定数量。

（2）将外源基因导入胚胎干细胞，筛选得到含目的基因的细胞，借助于

_____________________仪和__________________法可完成胚胎于细胞核移植；同时，

核移植前对胚胎干细胞进行培养等这些措施都有利于重组细胞中基因表达分子开关的

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启动。重组细胞经、、胚胎移植等过程可获得转基因

克隆动物。胚胎移植过程中，影响胚胎成活率的因素有（试举2

例）

【答案》5%的乙醇果胶酶和果胶甲酯酶灭菌一定量蔗糖维生素C

的含量光密度值防止酒精杀死醋杆菌果醋发酵温度较高，为需氧发酵，

果酒发酵温度较低，为厌氧发醉饲养层胶原蛋白显微操作细胞融合

胚激活胚胎培养胚胎移植时期、胚胎移植部位、胚胎移植环境温度、代孕

母发情状态等

【分析】

I、在利用酵母菌发酵时最好是先通入足够的无菌空气在有氧环境下一段时间使其繁殖,

再隔绝氧气进行发酵；酒精发醉的最佳温度是在18℃〜25C,pH最好是弱酸性。

2、醋酸菌好氧型细菌，当缺少糖源时和有氧条件下，可将乙醇（酒精）氧化成醋酸；

当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；醋酸菌生长的最佳温度是

在30℃〜35℃。

3、胚胎干细胞培养及应用（1）来源：囊胚内细胞团。（2）培养：一般用胚胎成纤维细

胞作饲养层培养胚胎干细胞，这样可以促进干细胞生长的司时抑制干细胞的分化。（3）

获取：把胚胎干细胞放到有饲养层的培养液中培养，直到内细胞团突出饲养层外，用酶

消化或机械剥离内细胞团，再把它用酶消化成单个细胞，置于新鲜培养液中培养。（4）

应用：①胚胎干细胞核移植：将胚胎干细胞核移植到去核卵细胞中，经过胚激活、胚胎

培养、胚胎移植后直接由受体完成克隆动物的技术。②用干细胞克隆器官，为器官移植

提供器官。

【详解】

（一）（1）利用舜猴桃直接制成的舜猴桃汁较为浑浊，加入95%的乙醇之后，会出现絮

状物，说明含有较多的果胶；果胶酶和果胶甲酯酶可以将果胶分解为半乳糖醛酸。

（2）将获得的狒猴桃汁置于90c环境中灭菌处理15分钟，以减少其他杀菌干扰；制

作出的果汁，加入活化的酵母悬液，再加入一定量蔗糖发酵，可以用来制作酒精含量较

高、含糖量也高的狒猴桃酒；由于维生素C与2,4•二硝基苯肿作用可形成红色产物,

采用光电比色法测定舜猴桃酒中维C的含量时，应先制作以维生素C的含量为横坐标、

以光密度值为纵坐标的标准曲线。

（3）为防止酒精杀死醋杆菌，因此将舜猴桃酒用蒸储水进行稀释；果醋发酵与果酒发

酵条件上的不同之处有果醋发酵温度较高，为需氧发酵，果酒发酵温度较低，为厌氧发

酵。

（二）（1）将获取的囊胚放在培养液中培养至内细胞团突出饲养层外；剥离内细胞团并

用胶原蛋白酶消化成单个细胞，继续培养胚胎干细胞至一定数量。

（2）将外源基因导入胚胎干细抱，筛选得到含目的基因的细胞，借助于显微操作仪和

细胞融合法可完成胚胎干细胞核移植；重组细胞经胚激活、胚胎培养、胚胎移植等过程

可获得转基因克隆动物；胚胎移植过程胚胎成活率的因素有胚胎移植时期、胚胎移植部

位、胚胎移植环境温度、代孕母发情状态等。

【点睛】

本题考查果酒和果醋制作及胚胎移植，要求考生识记参与果酒、果醋制作的微生物及其

代谢类型掌握胚胎移植的相关知识，能结合所学的知识准确答题。

5.（2020•北京西城•高三二模）为了应对干旱和强降雨等灾害性天气，很多城市增设了

雨水截流储存和利用的设施，如布设于道路周边或地势较低区域的生物滞留池。生物滞

留池内土壤、植物和微生物等构成了小型生态系统。某城市道路收集到的雨水含有高浓

度污染物，其中的多环芳煌（PAHs）,会严重危害城市水环境。科研人员基于解决污染

问题和维护生态安全两方面考虑，在从当地环境中筛选耐受菌的基础上，通过转基因技

术获得高效降解污染物的工程窗。

<1）经检测发现，生物滞留池内PAHs中的花含量相对较高。研窕者尝试筛选能降解

在的菌种。

①筛选能降解花的菌种基本操作步骤如下。请将下列“方框”内字母后面内容补充完整

倒平板，用£_______法接种

土埴浸出液；为避免污染，

操作应在超净工作台中的

d附近进行。

②从对照区域和生物滞留池中分别培养出占比较高的菌属，结果见图1、图2。在两个

区域中均能检测出的菌属有_______个，此结果能够说明滞留池土壤中________出现了

明显的变化。

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AaThaPseCtoEntComComNitStePlaPse

图1对照区域土壤占比较高的菌属帝留池中土壤占比较高的菌属

③在另一个筛选对花具有耐受性的菌株的实验中，分离得到四个菌属中的菌株，其生长

曲线见图3。研究人员欲从中选择一个构建工程菌。结合图1、图2所示结果，你认为

应选择,理由是o

09[1...................................................一

0102030405060708090100

时间h

图3四种菌株的生长曲线

（2）研究者将能高效降解花的外源基因重组至所选受体菌的同时，还转入了含lac启

动子的核酸酶基因。在半乳糖昔分子的诱导下该启动子会被激活，表达的核酸酶会将自

身遗传物质降解进而发生菌体自毁。转入该基因在维护生态安全方面的意义是。

（3）试举一例说明人类在改造自然的过程中，可能会带来的生物安全隐患o

【答案】a花b培养基（培养皿、接种环等）c稀释涂布平板d酒精灯火焰

（外焰）e菌落3微生物种类及比例PsePse菌株在对照池和滞留

池中均占比较大且对花的耐受性较好防止转基因微生物逃逸到自然界，将实验带来

的生态风险降到最低将外来物种引入新的环境，可能会造成生物入侵问题；转基因

生物可能会影响原有生态系统中的生物多样性等

【分析】

1.生物多样性是指生物圈内的所有的植物、动物和微生物（物种多样性），它们所拥有

的全部基因（基因多样性，也称遗传多样性）以及各种各样的生态系统（生态系统多样

性），包括物种、基因（遗传）和生态系统三个层次。

2.不适当引种的危害：澳大利正原来并没有仙人掌类植物，当地人从美洲引种一种仙

人掌作为篱笆，结果仙人掌过度繁殖，侵占大量的农田和耕地，给当地生态造成危害。

3.外来物种入侵的危害：外来物种入侵会严重破坏生物的多样性，并加速物种的灭绝；

外来物种入侵会严重破坏生态平衡：外来物种入侵会因其可能携带的病原微生物而对其

他生物的生存甚至对人类健康构成直接威胁。

4.基因污染指对原生物种基因库非预期或不受控制的基因流动，外源基因通过转基因作

物或家养动物扩散到其他栽培作物或自然野生物种并成为后者基因的一部分，基因污染

主要是由基因重组引起的。

【详解】

（1）①配制以花（a）为唯一碳源的培养基一为了获得纯净的培养物需要用高压蒸汽灭

菌法对培养基进行灭菌，同时对培养皿、接种环也要进行进行灭菌（b）一对灭菌完成

的培养基进行倒平板操作一然后用稀释涂布平板法对土壤浸出液进行接种（c）一接种

时，为避免杂菌污染，需要在酒精灯火焰（外焰）旁进行接种（d）一接种完成后需要

将平板放在恒温培养箱中进行培养一待菌落长出后，挑选颜色、大小等有差异的单个菌

落进行进一步的接种，进而对函种进行分离的鉴定（e）.

②根据图1、图2的结果可知，在两个区域中均能检测出的菌属有3个分别为Tha、Pse、

Com,该实验结果说明滞留池土壤中微生物种类及比例发生了明显的变化。

③由图3的生长曲线可推测四种菌种对花的耐受性均表现较好，但结合图1、图2所示

结果，发现只有Pse菌株在对照池和滞留池中均占比较大且对花的耐受性较好，因此研

究人员需要应选择Pse来构建工程菌。

（2）研究者将能高效降解他的外源基因重组至所选受体菌的同时，还转入了含lac启动

子的核酸酶基因。在半乳糖苜分子的诱导下该启动子会被激活，表达的核酸酶会将自身

遗传物质降解进而发生菌体自毁。据此可知转入该基因的意义在于能防止转基因微生物

逃逸到自然界，从而将实验带来的生态风险降到最低，避免引起生态危机。

（3）人类在改造自然的过程中，如将外来物种引入新的环境，可能会造成生物入侵问

题从而使入侵地的生物多样性锐减；转基因生物可能会引起基因污染，从而影响原有生

态系统中的生物多样性等。

【点睛】

解读题干中的信息并能进行分析综合是解答本题的关键！掌握微生物培养技术以及相关

的操作时解答本题的另一关键！

6.（2021•浙江）回答下列（一）、（二）小题：

（-）实验表明，细菌中芽抱杆菌降解率最高，真菌中毛霉降解率最高，且两者混合效

率更佳。回答与固定化混合菌对土壤中苯并花（BaP）降解效果有关的问题：

（1）高效降解菌筛选试验：土壤过2mm筛后，分装培养瓶中，每瓶30g,一C高压

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蒸汽灭菌15min,冷却后，在无菌条件下移入一定量的BaP丙酮溶液，放置过夜。再

按10%量接种菌悬液，通过灭菌棉塞控制通气量，以不加菌液为衣照，随时补加无菌

水，使土壤水分为30%,置25c恒温箱中避光培养，分别在每隔7d取样测定o

（2）实验中BaP的降解结果都有一个共同的趋势：前28d降解转化速度快，随后则出

现缓慢的反应趋势，有两方面的原因：其一，降低导致反应速度减慢；其二，BaP

降解过程是逐步进行的，中间产物与原加入的BaP的竞争代谢也有降低反应速度趋势

的可能性。

（3）固定化混合菌的制备：将建石载体处理后，再接种游离的一，随着混合菌的生

长，部分微生物自然固定在载体上，培养结束后用_____洗涤固定化混合菌细胞数次，

便制得固定化混合菌，以为对照，通过两者质量差计算蛭石对微生物的o

（二）回答与转基因雷公藤培育过程有关的问题：

（1）将含酶的混合液在552水浴锅中活化，0.22pm微孔滤膜灭菌。取雷

公藤悬浮细胞，加入酶混合液，黑暗条件下培养以分离原生质体。

（2）原生质体的活力检测采用台盼蓝染色法（台盼蓝可穿透死细胞的细胞膜，使死细

胞中的DNA着色，但无法进入活细胞内），原生质体活力的计算方法为：占该视

野下原生质体总数的百分比。

（3）由于原生质体来源于黑暗条件下培养的雷公藤悬浮细胞，因此其细胞中不含o

将原生质体与含的植物表达载体质粒混合，在黑暗条件下完成转化后，再用激光

作扫描光源的显微镜观察，统计发出绿色荧光的原生质体数占观察到的所有原生质体数

的百分比，以此确认原生质体的转化效率。

（4）将转化后的原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞。此时，应该

培养基中廿露醇浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后形成再生植株。再生

植株需去除处理，并进行锻炼后才能移种大田。

【答案】121土壤中BaP的残留量BaP质量分数芽泡杆菌和毛霉无菌

水不接种混合菌的空白蛭石吸附量纤维素酶和果胶过滤悬浮

未被台盼蓝染色的原生质体

叶绿体

绿色荧光蛋白基因

降低

根部残留的培养基

【分析】

1、培养基灭菌的方法：培养基采用高压蒸汽灭菌，将灭菌物品放置在盛有适量水的高

压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为lOOkPa,温度为121℃的条件

下，维持15〜30min。

2、固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的

技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更合适采用化学结合和物

理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞体积大，而睡分子小；体

积大的细胞难以被吸附或结合，而体积小的前容易从包埋材料中漏出。

3、植物组织培养过程是：离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再

分化生成根、芽，最终形成植物体。植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。

4、植物的体细胞杂交是将不同值物的细胞通过细胞融合技术形成杂种细胞，进而利用

植物的组织培养将杂种细胞培育成多倍体的杂种植株。植物体细胞杂交依据的原理是细

胞膜的流动性和植物细胞的全能性。

【详解】

（-）（1）高效降解菌筛选试验：土壤过2mm筛后，分装培养瓶中，每瓶30g,用高

压蒸汽灭菌法进行灭菌，即121℃高压蒸汽灭菌15min,冷却后，在无菌条件下移入一

定量的BaP丙酮溶液，放置过夜。再按10%量接种菌悬液，通过灭菌棉塞控制通气量，

以不加菌液为对照，随时补加无菌水，使土壤水分为30%,置25c恒温箱中避光培养，

分别在每隔7d取样测定土壤中BaP的残留量，通过残留量的多少来判断降解效果。

（2）实验中BaP的降解结果都有一个共同的趋势：前28d降解转化速度快，随后则出

现缓慢的反应趋势，有两方面的原因：其一，BaP质量分数降低导致反应速度减慢；其

二，BaP降解过程是逐步进行的，中间产物与原加入的BaP的竞争代谢也有降低反应速

度趋势的可能性。

（3）固定化混合菌的制备；将姓石载体处理后，再接种游离的混合菌（芽抱杆菌和毛

霉），随着混合菌的生长，部分微生物自然固定在载体上，培养结束后用无菌水洗涤固

定化混合菌细胞数次，便制得固定化混合菌，以不接种混合菌的空白蛭石为对照，通过

两者质量差计算蛭石对微生物的吸附量。

（二）（1）根据酶的专一性，将含纤维素睡和果胶酶的混合液在55c水浴锅中活化，

0.22pm微孔滤膜过滤灭菌。取雷公藤悬浮细胞，加入酶混合液，黑暗条件下悬浮培养

以分离原生质体。

（2）原生质体的活力检测采用台盼蓝染色法，未被台盼蓝染色的原生质体为有活力的，

因此原生质体活力的计算方法为：未被台盼蓝染色的原生质体占该视野下原生质体总数

的百分比。

（3）由于原生质体来源于黑暗条件下培养的雷公藤悬浮细胞，黑暗条件下叶绿素无法

试卷第12页，总186页

合成，因此其细胞中不含叶绿体。将原生质体与含绿色荧光蛋白基因的植物表达载体质

粒混合，在黑暗条件下完成转化后，再用激光作扫描光源的显微镜观察，统计发出绿色

荧光的原生质体数占观察到的所有原生质体数的百分比，以此确认原生质体的转化效率。

（4）将转化后的原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞。此时，应该降

低培养基中甘露醇浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后形成再生植株。再

生植株需去除根部残留的培养基处理，并进行锻炼后才能移种大田。

【点睛】

本题主要考查微生物的分离与培养、固定化酶的应用、植物组织培养和植物体细胞杂交

等内容，要求考生识记相关知识，意在考查学生识记所学知识要点，把握知识间的内在

联系，形成知识网络的能力，同时获取题干信息准确答题。

7.（2020•全国）请回答以下基因工程方面的有关问题：

（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。

图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

iimiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiNii

B变性

。退火

第一轮循环＜

IIIINIIt

31物B

iiiiaiiMi引物A

Q延伸

iiiiiiiiiiiiiaiiiiiiaiiiiiiiiiiiniiiiiiiiiiii

iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiniiiiiiiiiii

。变性

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为

②在第轮循环产物中开始出现两条脱氧核昔酸链等长的DNA片段。

（2）设计引物是PCR技术的关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分

碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。

第1组户物I•IIIIII

引物1引物口.CAGGCT

1"I~I-1~I-I

AGCCTG

第2组［引物］'•1"I~I-I_II~I~।-I~r

引物1引物(•AACTGCAGTT

CGACTGATTA

①第］组：;②第2组：

(3)PCR反应体系中含有热稔定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚

合酶的功能，这是因为。

【答案】15/16三引物I和引物H局部发生碱基互补配对而失效引物I'自

身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效DNA聚合的只能将单个脱氧核甘酸连续

结合到双链DNA片段的引物链上

【分析】

采用PCR技术扩增DNA的过程为：变性、退火、延伸，能根据PCR过程的特点，绘

制PCR过程示意图是解决本题的关键。

【详解】

(1)①由图可知，以原来的每条母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物A

或引物B,而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第四轮

循环共产生16个DNA分子，其中含有引物A的分子是15个，占15/16。②第一、二

轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点，前两轮循环产生的4个DNA分

子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核甘酸链。

试卷第14页，总186页

（2）引物是单链DNA时才能与DNA结合，而单链DNA的碱基互补配对部分容易形

成双链结构而失去其功能。从图示可以看出，第1组引物I和引物H局部碱基互补配对,

易形成双链结构而失效。第2组引物相互间不能发生碱基互补配对，但引物r自身

折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。

（3）DNA聚合酶的作用是将单个脱氧核苜酸连续结合到双链DNA片段的引物链上，

而不能直接将两个脱氧核甘酸连在一起。

【点睛】

本题结合PCR过程示意图，考查PCR技术、DNA分子复制、基因工程等知识，要求

考生识记PCR技术的过程及原理，能分析题图提取有效信息答题：掌握DNA分子半保

留复制特点，能进行简单的计算。

8.（2020•吉林长春市•东北师大附中）科研人员尝试利用某种细菌限制蓝藻的数量，相

关实验如下图，图中①~⑥表示实验步骤。回答下列问题：

蓝藻溶藻细菌

①光照下，振荡培养④振荡培养

|②接种⑤实验组：取菌液滴加在培养皿

遏I

砧⑥光照培养3d..观察结果

（1）从生态系统的营养结构上看，蓝藻处于;蓝藻的代谢类型是

（2）本实验涉及微生物接种技术，微生物的接种技术有平板划线法、法、

斜面接种法和法，本实验步骤②和⑤采用的接种方法为

（3）实验步骤①和④均需振荡培养，步骤①振荡培养的目的是增加培养液中

的含量，以及增大蓝藻与培养液的接触面积，提高培养基中营养物质的

（4）本实验操作中需要配制固体培养基，即平板。倒平板冷凝后，将平板倒置，既可

以防止__________________________________________________________,又可以避免培

养基中的水分快速挥发。

（5）图中⑤实验组在每个培养皿中，如果做三个重复实验，可采取的做法是

o为完善实验设计方案，应增设对照组，设计对照组的目的是

【答案】第一营养级自养需氧型稀释涂布平板穿刺接种稀释涂布平板

法溶解氧利用率培养皿盖上的水珠滴入培养基在每个培养皿中，选择

三个不同位置，各滴加等量菌液排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高

实验结果的可信度

【分析】

分析实验的示意图看出，本实验探究了溶藻细菌对蓝藻生长的影响。

蓝藻属于原核生物中的一种，原核生物没有由核膜包被的典型的细胞核，而蓝藻比较特

殊，其细胞中含有叶绿素，因此可以进行光合作用合成有机物。

【详解】

（1）蓝藻是原核生物，能进行光合作用，是自养需氧型生物，在生态系统的成分中属

生产者，在营养结构中是处于第一营养级。

（2）微生物的接种技术有平板划线法、稀释涂布平板法、斜面接种法、穿刺接种法等，

本实验步骤②和⑤采用的接种方法为稀释涂布平板法。

（3）实验步骤①和④均需振荡培养，步骤①振荡培养的目的是增加培养液中溶解氧的

含量，以及增大蓝藻与培养液的接触面积，提高培养基中营养物质的的利用率，微生物

生长速度加快。

（4）倒平板冷凝后，将平板倒置，既可以防止培养皿盖上的水珠滴入培养基，又可以

避免培养基中的水分快速挥发。

（5）题干中已经提示，“在每个培养皿中加做三个重复实验“，所以只能在一个培养皿

中选择三个不同位置，且是重复实验，处理条件是完全相同的。设计对照组的目的是排

除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

【点睛】

本题考查了蓝藻的生物分类、代谢类型、微生物的生长和代谢以及相关实验设计的知识,

具有一定的综合性，要求考生具有一定的识记能力和对实验进行完善和修订的能力，属

于中等难度题。

9.（2021•江苏南通•高三一模）大丽轮枝菌（一种丝状真菌）是引起棉花黄萎病的主要

病原菌。为观察大丽轮枝菌对棉花根侵染路径，研究人员利用绿色荧光蛋白基因（sGFP）

转染大丽轮枝菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如下（图中a链和

试卷第16页，总186页

b链分别是相应基因转录模板链)。分析回答:

限制的识别序列和切割

痴汨I：5GGATCCW

H/*Hl5AiAGCTT三

③农杆菌介卑有球色

吴丽轮

(1)过程①中，PCR扩增sGFP的原理是,该过程除需要根据设计特异

性引物序列外，为保证sGFP正确插入到质粒中，还需要在引物的5,端添加限制酶识别

序列，图中b链的黏性末端碱基序列为。

(2)过程①中，若1个sGFP片段连续扩增4次，则会形成个两条链等长的sGFP

片段。

(3)过程②需要的工具酶是o研究中将sGFP插入到构巢曲霉启动子和终止子

之间的目的是o

(4)过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80C左右后，加

入用配制的适宜浓度的潮霉素溶液，潮霉素不能与培养基一同灭菌的原因是

(5)选择过程③筛选培养得到的不同农杆菌菌落，分别提取细菌质粒DNA,并用

BamHI和HindlD完全酶切后电泳，请在答题纸相应位置画出可能得到的电泳条带。

(6)将导入重组质粒的农杆菌加入大丽轮枝菌的胞子细胞悬液中，在适宜条件完成转

染后利用滤膜过滤得到抱子细胞，再在真菌培养基上培养获得菌落，最终通过检测

筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。

【答案】双链DNA复制sGFP两端(3,端)核苜酸(或碱基)序列AGCT8

DNA连接酶保证sGFP能在大丽轮枝菌细胞中表达无菌水潮霉素在灭菌

标准质粒重组质粒

加样处

40

HX)bp|

36

K)Obp二

2X0X)bp

时结构被破坏KX)bp大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色

1050bp

bp

700

50bp

500bp

2

1

荧光强度1

【分析】

1、基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启

动子、终止子和标记基因等；

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基

因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动

物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法;

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA

是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA一分子杂

交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原•抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：

抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

2、根据PCR过程的特点可绘制1个sGFP片段复制图示如下：

起始第一轮第二轮第三轮

【详解】

（1）PCR扩增sGFP的原理是双链DNA复制，由于DNA两条链反向平行，且DNA

聚合酶只能使新合成的DNA子链从•向延伸，所以该过程需要根据sGFP两端（3,

端）核甘酸（或碱基）序列设计特异性引物序列，为了保证sGFP正确插入到质粒中,

试卷第18页，总186页

还需要在引物的5端添加限制酶识别序列，由于质粒大片段是利用HindlH和BamHI共

同切割得到的质粒的长片段，所以B链5,是利用HindIH切割形成的黏性末端，根据

HindlH识别的碱基序列可知，图中b链的黏性末端碱基序列(5,一3，)为AGCT。

(2)由分析图示可知，第一、二轮循环合成的子链长度均不同，第三轮循环产生的子

代DNA分子中，存在两个含有等长的两条核甘酸链的DNA分子，即仅含引物之间的

序列，第三轮的DNA再进行一次半保留复制，可形成8个两条链等长的sGFP片段。

(3)过程②为构建重组DNA,需要的工具酶是DNA连接酶。启动子是RNA聚合酶

识别和结合的部位，而终止子是使转录终止的序列，而目的基因不携带启动子和终止子,

所以将sGFP插入到构巢曲霉启动子和终止子之间的目的是保证sGFP能在大丽轮枝菌

细胞中表达。

(4)过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80c左右后，加

入用无菌水配制的适宜浓度的潮霉素溶液，以防止杂菌污染。由于湖霉素在灭菌时结构

被破坏，不能发挥选择作用，所以潮霉素不能与培养基一同灭菌。

(5)根据质粒中BamHI和HindlH的识别位点、以及用BamHI和HindlH酶切后得到

的质粒大片段为3500bp,可知质粒小片段应为3750-3500=250bp,电泳应出现3500bp

和250bp两种片段。sGFP的基因长度为720bp,质粒大片段为3500bp,二者连接后的

长度为3500+720=4220bp。用BamHI和HindlH完全酶切后电泳会形成3500bp和720bp

两种片段。所以酶切后的电泳图示为

标准质粒重组质粒

加样处"fcl

4000bp

3000bp

2000bp

lOOObp

750亩

500：

250bp

lOObp

(6)转基因成功的标志是形成目的基因的产物，所以最终可通过检测大丽轮枝菌菌丝

细胞中绿色荧光I强度，以筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。

【点睛】

本题主要考查基因工程相关知识，要求考生掌握基因工程的操作步骤，能准确识别图示

的各个过程，理解基因表达载体的组成及其各组分的作用，理解PCR扩增的原理和过

程。

10.（2021•山东滨州•高二期末）保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是酸奶生产中的两种常用

乳酸菌种,二者共生使牛乳快速发酵制成酸奶。研究者以一株保加利亚乳杆菌（记作A）

和一株嗜热链球菌（记作B）为实验材料，对脱脂乳进行发酵，研究两者共生机制以期

提高酸奶品质。

（1）发酵前先将A和B菌种接种到M17培养基中培养进行活化，M17培养基的配方

如下表所示，其中乳糖为菌种生长提供的营养成分是。从物理性质上划分,

该培养基属于培养基，判断依据是。活化培养过程应控制的氧气

条件是（填“无氧”或“有氧

表M17培养基的配方

组蛋白酵母提取牛肉乳抗坏血伊甘油磷酸二

MgSO4-7H2O

分陈物膏糖酸钠

含10.05.0

2.5g5.0g0.5g0.2g5g

量gg

调节pH至7.0,定容至500mL

（2）取等量活化好的A和B菌种分别接种到250mL发酵培养基中开始发酵，发酵培

养基的成分应为。每隔2h取出发酵液，测定pH值和菌种数量，结果如图

1、图2所示。据图可知，数量增长更快的菌种为,发酵过程中具有持续产

酸能力的菌种是

日6.0

S1.0

旦

封5.0.8

包

电招

4.0.46

3.0?.『

。

甚

黝2.0

.2

S1.0S

246810121416182022244681012141618202224

时间（h）时间(h)

图1A菌数列与发酎液pH值图2B菌数列与发酬液pH值

（3）发酵过程中B代谢可产生大量丙酮酸、甲酸、叶酸等物质，其中甲酸是喋吟合成

的前体物质，叶酸是嚓吟和氨基酸合成的辅因子。将A和B菌种共同接种到250mL

发酵培养基中，测定pH值和A、B菌种总量，结果如图3所示。进一步检测发现，共

同培养初期A的增长速度明显高于单独培养,结合上述信息分析其原因是。

16小时后，共同培养的菌种数量开始减少的主要