DB51T 2478-2018 植物检疫实验室常规检验技术 病毒　

植物检疫实验室常规检验技术病毒2018-04-18发布2018-05-01实施四川省质量技术监督局发布I 1 1 14试剂与材料 1 26取样及送样 37检测方法 38结果判定 39样品保存 3附录A(资料性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒主要症状特征 4附录B(资料性附录)李属坏死环斑病毒主要症状特征 5附录C(资料性附录)烟草环斑病毒主要症状特征 6附录D(规范性附录)酶联免疫吸附测定法检验程序 7附录E(规范性附录)RT-PCR检验程序 9Ⅱ本标准依据GB/T1.1-2009给出的规定进行编写。本标准中附录A、B、C为规范性附录，附录D、E为规范性附录，。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。本标准起草人：万佳、宁红、邓亚岷、李刚、蒋辉、吴志平、郭迪金、李小松。1DB51/T2478—植物检疫实验室常规检验技术病毒本标准规定了植物检疫实验室病毒检验的原理、试剂与材料、仪器与用具、取样及送样、检测方法、结果判定和样品保存。本标准适用于植物检疫实验室病毒的检验和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB15569农业植物调运检疫规程病毒病一般根据病害症状很难确定病毒种类，采用免疫学和分子生物学方法，可快速根据有关判断标准进行检验鉴定。4试剂与材料4.1DAS-ELISA血清学检验试剂除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。a)包被抗体：病毒抗体稀释度按市售产品要求进行。贮藏于4℃备用；b)酶标抗体：用碱性磷酸酶标记的病毒免疫球蛋白抗体。按市售产品要求进行稀释，贮藏于4℃冰箱保存备用；c)包被缓冲液：取2.93g碳酸氢钠(NaHCO3)、1.59g碳酸钠(Na2C03),用1000ml蒸馏水溶解，pH值为9.6,贮藏于4℃冰箱保存备用；d)PBST洗涤液：取1.15g无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、0.2g氯化钾(KC1)、0.2g无水磷酸二氢钾(KH2PO4)、8.0g氯化钠(NaCl)、0.5ml吐温-20,用1000ml蒸馏水溶解，pH值为7.2;e)样品提取缓冲液：取20g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2.0g蛋清蛋白、1.3g无水亚硫酸钠(Na2SO3)、0.2g叠氮化钠(NaN3)、0.5ml吐温-20、8g氯化钠、0.2g磷酸二氢钠、1.15g磷酸氢二钠、0.2g氯化钾，用1000ml蒸馏水溶解，贮藏于4℃冰箱保存备用；。f)共轭物缓冲液：取0.2g牛血清白蛋白，用100mlPBST缓冲液溶解，贮藏于4℃冰箱保存备g)底物：对硝基苯磷酸二钠；h)底物缓冲液：取0.1g氯化镁(MgCl2)、90.39g二己醇胺(CH2CH2OH)、19.82g二己醇胺-HCl(CH2CH2OH-HCl),用1000ml蒸馏水溶解，pH值为9.8,贮藏于4℃冰箱保存备用；2i)终止液：12g氢氧化钠(NaOH)溶于100ml蒸馏水。4.2RT-PCR检验试剂a)莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶：100U/μl;b)1×TAE缓冲液：40mMTris-HCl,20mMNaAc,2mMEDTA(用冰醋酸调pH至8.0)。d)10×PCR缓冲液：100mMTris-HCl(pH8.3),500mMKCl;f)RNA酶抑制剂：10U/μl;h)无水乙醇(CH3CH2OH);j)去蛋白液；k)Taq酶2.5U/μl;n)2-巯基乙醇(C2H60S);p)相应病毒引物；r)溴酚蓝(C19H1OBr405S);s)琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖缓缓倒入250ml三角瓶内，加入100ml1×TAE,在微波炉中加热1min溶解后，再加入5μlGoldview的生物染料，倒入调平并安放适当梳齿的制胶a)聚乙烯微量滴定板根据样品数量选用48孔和96孔两种规格。c)电子天平1/100g,1/1000g。d)恒温培养箱。f)酶联免疫检测仪。i)PCR扩增仪。j)研钵内径60mm~80mm。k)冰箱、超低温冰箱。3调运检疫样品按照GB15569中附录D和附录E相关规定进行取样，产地检疫样品按照相应的检疫性有害生物产地检疫技术规程规定的取样要求进行取样，疫情监测样品按照相应的检疫性有害生物监测防控技术取样要求进行取样。在调运检疫、产地检疫及疫情监测过程中，采集具有可疑症状的叶片、枝条、果实、种子等材料，用纸袋包装，并注明采样地点、品种、GPS、采样人、采样时间等，在保证不腐烂的前提下及时送检。7.1症状观察观察样品有无异样，初步判断是否具有病毒的表现特征(见附录A、B、C)。7.2DAS-ELISA血清学检验检验方法见附录D。如采用认可的试剂盒，按说明操作。检验方法见附录E。如采用认可的试剂盒，按说明操作。在阴性对照OD值≤0.1,且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带相应的被检病毒；否则判定为阴性反应，即样品不带相应的被检病毒。在阴性对照、空白对照无扩增条带，且阳性对照出现被检病毒目标条带的前提下，样品RT-PCR产物电泳结果与被检病毒目标条带长度一致，判定为阳性反应，即样品带被检病毒；否则判定为阴性反应，即样品不带被检病毒。经检疫鉴定后的样品，应在-80℃~-20℃冰箱保存三个月，以备复验、谈判和仲裁，保存期满后，需进行灭活处理。4(资料性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒主要症状特征A.1危害与症状该病毒主要危害黄瓜、西瓜、南瓜和甜瓜等葫芦科作物。一般造成减产20%以上，严重的甚至绝收。在西瓜叶片只产生轻微的斑纹和矮化，但在果实中却造成严重的变色或使果实内部造成腐烂，在黄瓜叶片上出现色斑，水泡及变形，植株矮化，病株开花迟、少花，不结果或果畸形。A.2传播途径该病主要通过种子进行传播，也可通过土壤、水、介体、农事操作和机械接触传播。A.3检疫措施种植经检疫合格的健康种子，严禁发生区内的种苗外调；及时挖除发病植株，就地集中晒干焚烧；播种前用3~10%亚磷酸三钠浸种10分钟，发病田土壤和农具用100倍福尔马林处理后覆膜封闭5-7天；发病田改种非葫芦科作物两年以上。5(资料性附录)李属坏死环斑病毒主要症状特征B.1危害及症状该病毒几乎可侵染所有的李属植物，引起坏死、皱缩、花叶、环斑、穿孔、枯死等，特别在苗期发生会造成严重损失。典型症状是新叶上出现坏死环斑或黄条斑，坏死斑中心脱落，出现孔洞，重者只剩下花叶状叶架。B.2传播途径该病毒主要通过种子和苗木传播，嫁接及农事操作也可传播。B.3检疫措施种苗调运时实施检疫；建立无毒种苗繁育基地，发展无疫病优质果树生产区；选择抗病毒药剂进行化学防治，重点进行药剂灌根和主干环剥涂药。6(资料性附录)烟草环斑病毒主要症状特征C.1危害及症状该病毒主要为害烟草、番茄、马铃薯、大豆、西瓜、黄瓜等作物，可导致减产和产品质量下降。在烟草叶片上产生环斑，病斑常由断续的坏死线局限起来，呈粉白色或棕色单环或双环，直径约5～8mm,与病斑相邻组织褪绿，有时形成一个晕圈。为害大豆，引起植株顶芽弯曲变褐枯死，其他侧芽变褐色，茎和复叶叶柄产生褐色条纹，豆荚发育不良。C.2传播途径该病毒主要通过种子传播，在田间主要靠汁液摩擦接触传播，病毒多通过叶片和根部伤口进入，昆虫、线虫可造成植株伤口，并传播病毒。C.3检疫措施实施严格的检疫制度，对寄主繁殖材料实施检疫；珍贵寄主材料，可进行茎尖脱毒处理；药剂防治传毒昆虫及线虫，可以减少病毒株间的传播；与非寄主作物轮作；利用基因调控在遗传育种上获得抗病7(规范性附录)酶联免疫吸附测定法检验程序D.1包被抗体D.1.1包被用包被缓冲液稀释病毒包被抗体，在所需反应孔中加入100μL。将酶联反应板置于保湿容器中，37向每个反应孔中加入200μLPBST洗涤液，迅速倒出，重复2次。洗板完成后将酶联反应板在纸巾上D.2.1样品制备将待测样品剪碎混匀后取其中1g置于研钵中，加入10ml样品提取液充分研磨后，以一层薄棉布(或类似细棉纱)过滤样品。在样品制备过程中应注意防止样品的交叉污染。用移液器将制备好的样品按每孔100μL加入酶联反应板孔内，每个样品重复一次，设置阳性对照、阴性对照和包被缓冲液空白对照。加样完成后将酶联反应板置于保湿容器中，4℃冰箱孵育过夜(至少16h)。剩余样品于-20℃冰箱保存备查。在每个反应孔加满PBST洗涤液，迅速倒出，重复2次。洗板完成后将酶联反应板在纸巾上拍干。D.3结合酶标抗体D.3.1加酶标抗体向酶联反应板每孔加入100μL用共轭物缓冲液按比例稀释的酶标抗体溶液。置于保湿容器中37℃同D.2.3,重复4次。8每孔加入100μL底物溶液。25℃避光孵育1h,至阳性对照显色。D.5终止反应9DB51/T2478—(规范性附录)RT-PCR检验程序E.1病毒模板RNA的制备采用TIANGENRNAprepPlantKit试剂盒(给出该试剂盒信息是为了方便标准使用者，如果等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品)提取病毒RNA。称取50mg~100mg的叶片、茎杆或种子，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移粉末至预冷的1.5ml的EP管中，加入500μL的RL裂解液(使用前按RL裂解液1ml加入2-巯基乙醇10μL),涡旋剧烈震荡5min使其混匀。将匀浆液转移至CS过滤柱上，12000rpm离心2min~5min,小心吸取上清液至无RNA酶(RNase-free)的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。缓慢加入上清液0.5倍体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入CR吸附柱中，12000rpm离心1min,弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入700μL去蛋白液RW1,12000rpm离心1min,弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入500μL漂洗液RW,12000rpm离心1min,弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复漂洗一次。漂洗完后，将吸附柱在12000rpm离心2min,,去除残余液体，并在室温下放置片刻。将吸附柱放入一个新的RNase-free离心管中，向膜中央加入50μL～100μL无RNA酶的双蒸水，室温放置2min,12000rpm离心2min,得到RNAE.2.1反转录E.2.1.1反应体系RT反应体系见表E.1。表E.1病毒RT反应体系物加入量(μL)41E.2.1.2程序反转录程序为：42℃,50min;94℃,5min;4℃保存。E.2.2.1反应体系E.2.2.2反应程序反应程序为：94℃3min;94℃30sec,59℃30sec,72℃30