生物技术制药 课件 2.基因工程制药-1

基因工程制药-1

geneticengineeringpharmaceutics张革中山大学药学院微生物与生化制药实验室zhangge@12/29/20241中山大学药学院张革基因工程（GeneEngineering):基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的.

其基本步骤

(1)提取目的基因.

(2)目的基因与运载体结合.形成一个重组DNA分子.

(3)将目的基因导入受体细胞.(4)目的基因的表达.基因工程技术最成功的成就:用于新型生物技术药物的研制12/29/20242中山大学药学院张革12/29/20243中山大学药学院张革41、限制性核酸内切酶是一类能识别特殊核甘酸序列，并水解DNA分子的磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵作用。一、基因工程菌的构建与筛选

（一）工具酶12/29/20244中山大学药学院张革Ⅱ型酶识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。51）II型限制性内切酶的基本特征5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点12/29/20245中山大学药学院张革62）核酸内切酶作用后的断裂方式

粘性末端：12/29/20246中山大学药学院张革平末端：

12/29/20247中山大学药学院张革12/29/20248中山大学药学院张革3）同裂酶（isoschizomers)

指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶(CCGG)，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。SmaI(Serratia

marcescensSB) CCC^GGGXmaI(Xanthomonas

malvacaerum) C^CCGGG12/29/20249中山大学药学院张革4）同尾酶（isocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。

。杂种位点（hybridsite）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。GGATCC TGATCACCTAGGACTAGTBamHⅠBclⅠG GATCACCTAGTGGATC

ACCTAGT12/29/202410中山大学药学院张革6）影响核酸内切酶活性的因素（1）DNA的纯度：为提高RE对低纯度DNA的反应效率，一般:a.增加RE的用量b.扩大酶催化反应的体系(稀释)c.延长酶催化反应的保温时间。（2）DNA的甲基化程度RE是原核生物限制-修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的E.Coli菌株制备质粒DNA。12/29/202411中山大学药学院张革（3）酶切消化反应的温度：大多数37℃,但也有例外SmaI是25℃、ApaI是30℃；MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；还有些RE最适温度高达60℃以上（4）DNA的分子结构：某些RE切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。还有一些RE切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差造成的。12/29/202412中山大学药学院张革（5）反应系统的组成氯化镁,氯化钠或氯化钾：不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低RE的活性，还可能导致识别序列的改变。Tris-HCl：维持最适的pH值（pH＝7.4）。β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：维持酶的稳定性。牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。12/29/202413中山大学药学院张革12/29/202414限制性内切酶在DNA克隆中的应用12/29/202414中山大学药学院张革限制性内切酶市场新英格兰公司(NewEnglandBiolabs，NEB)是目前限制性内切酶市场主要供应厂商。超过30%已知的限制性内切酶是首先在NEB发现的北美市场，Promega的产品欧洲市场，RocheApplied和Fermentas公司。日本市场，Takara的产品

12/29/202415中山大学药学院张革2、DNA连接酶能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。12/29/202416中山大学药学院张革大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。可以封闭双螺旋DNA上具有5‘-磷酰基和3’-羟基的缺口（nick），不能封闭裂口（gap）；因此，只能连接粘性末端的DNA片段，不能拼接DNA平头末端；用于粘性末端DNA或切口间连接。12/29/202417中山大学药学院张革T4DNA连接酶（DNAligase）

该酶常从T4噬菌体的感染细胞中提取，是由T4噬菌体基因组所编码的，它可催化DNA中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。基因工程中常用的连接酶是T4连接酶。DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。12/29/202418中山大学药学院张革3、DNA聚合酶DNA聚合酶 催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均缩写为DDDP。12/29/202419中山大学药学院张革大肠杆菌DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ（PolI）、

DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）、

DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）、

PolI和PolⅡ的主要功能参与DNA的合成；

PolⅢ的功能同DNA的复制有关；

Pol

Ⅰ

同DNA分子克隆的关系最为密切。12/29/202420中山大学药学院张革（1）大肠杆菌DNA聚合酶IDNA聚合酶Ⅰ的酶活性：

5’→3’的聚合酶活性；

5’→3’的外切酶活性；

3’→5’的外切酶活性（较低）。

3′5′3’→5’外切酶活性5’→3’外切酶活性

3′5′

3′5′5′

3′12/29/202421中山大学药学院张革（2）Klenow

聚合酶Klenow片段（Klenowfragment）：E.coliDNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个aa片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性，但失去了5’→3’外切酶活性。

5’

→3’聚合酶活性；

5’

→3’外切酶活性；

3’

→5’外切酶活性。5’

→3’聚合酶活性；

3’

→5’外切酶活性部分水解12/29/202422中山大学药学院张革23用途⑴补平3‘-凹端利用5‘→3‘DNA聚合酶活性

在模板和引物(DNA或RNA)存在的条件下,以dNTP作底物,沿5‘→3‘方向合成与模板互补的DNA。

12/29/202423中山大学药学院张革12/29/202424⑵3’-凹端标记12/29/202424中山大学药学院张革12/29/202425⑶、3‘-凸端削平利用单链特异性的3→5外切核酸酶活性

12/29/202425中山大学药学院张革(3)T4噬菌体DNA聚合酶活性：5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA强。在没有dNTP存在的情况下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按3’→5’的方向从3’-OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。12/29/202426中山大学药学院张革3′→5′外切酶活性

3′T5′

3′5′GTCAGTCACAC12/29/202427中山大学药学院张革3′→5′外切酶活性dATP

3′T5′

3′5′GTCAGTCAdATPdATPdATPCAC12/29/202428中山大学药学院张革4.T7噬菌体DNA聚合酶活性：5`→3`聚合酶活性；有单链及双链的3`→5`外切酶活性，但无5`→3`外切酶活性；特点：极佳的连续合成能力应用：（1）用于长模板DNA的引物延伸反应；（2）通过单纯的延伸或取代合成途径标记DNA3`末端；（3）使双链DNA的5`或3`突出末端变成平末端。12/29/202429中山大学药学院张革5.TaqDNA聚合酶显著特点：热稳定性70℃反应2h残留活性为原来的90%；93℃反应2h残留活性为原来的60%；94℃反应2h残留活性为原来的40%。应用：（1）DNA序列测定（2）PCR(polymerasechainreaction)对DNA的特定片段进行体外扩增。12/29/202430中山大学药学院张革6.逆转录酶（reversetranscriptase）

逆转录酶这类酶来自于逆转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成DNA。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）逆转录酶两种。RNA指导的DNA聚合酶。12/29/202431中山大学药学院张革活性：5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的RNA或DNA。用途：（1）在体外以mRNA为模板合成cDNA；（2）对有5`突出末端的DNA片段作末端标记（补平）；（3）双脱氧法测序；（4）以DNA或RNA为模板合成核酸探针。12/29/202432中山大学药学院张革（7）末端转移酶末端转移酶(terminaltransferase):

末端脱氧核苷酸转移酶。来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。功能：催化5`脱氧核苷三磷酸进行5`→3`方向的聚合作用,逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3`-OH端。是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。用途：

(1)用于给外源DNA片段和及载体分子加上互补同聚物尾巴；

(2)标记DNA片段的3`末端。12/29/202433中山大学药学院张革34与聚合酶的不同：12/29/202434中山大学药学院张革逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3`-OH端同聚物加尾12/29/202435中山大学药学院张革大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌

12/29/202436中山大学药学院张革碱性磷酸酶功能：催化核酸脱5’-P基团，使DNA或RNA片段5’-P末端转换成5’-OH末端。来源：有两种，分别来自于大肠杆菌和小牛肠道，前者叫bacterialalkalinephosphatase(BAP);后者叫calfintestinalalkalinephosphatase(CIP)

用途：去除DNA片段5‘磷酸，防止自身环化；同位素32P标记前的去除5‘磷酸。12/29/202437中山大学药学院张革5‘3’3‘5’P--OH-PHO-碱性磷酸酶的活性碱性磷酸酶5‘3’3‘5’HO--OH-OHHO-12/29/202438中山大学药学院张革T4多核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase）来源：T4噬菌体感染的E.coli。功能：催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA/RNA的5‘-OH端某些情况下，上述的多聚核苷酸的反应可以反方向进行，将ATP的γ-磷酸基团与多聚核苷酸的5’端磷酸基团交换，从而不必用碱性磷酸酶对底物进行脱磷酸化。用途：标记DNA的5’-末端；使缺失5‘-P末端的DNA发生磷酸化作用。12/29/202439中山大学药学院张革T4多核苷酸激酶的活性正向反应交换活性12/29/202440中山大学药学院张革S1核酸酶来源：来源于稻谷曲霉（Aspergillus

oryzae）功能：是一种高度单链特异的核酸内切酶。注意：对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。12/29/202441中山大学药学院张革P--OHP--OHP--OHP--OHP--OHP--OH单链DNA或RNA带缺口的双链DNA5‘-磷酸单核苷酸或寡核苷酸S1核酸酶S1核酸酶12/29/202442中山大学药学院张革12/29/202443中山大学药学院张革(二）载体载体(vector)，基因工程上的载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子。基因工程中有三种主要类型的载体∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒。12/29/202444中山大学药学院张革载体必须具备的几个性能分子较小，可携带比较大的DNA片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种RE的切割位点，但每一种RE又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。有适合的标记，易于选择。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。12/29/202445中山大学药学院张革12/29/202446中山大学药学院张革载体的分类根据功能克隆载体:

克隆一个基因或DNA片断表达载体:

用于一个基因的蛋白表达整合载体:

把一个基因插入到染色体组中12/29/202447中山大学药学院张革根据来源：

质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体真核细胞表达载体其中质粒DNA是最常用的载体，但运载能力低，柯斯质粒是质粒和λ噬菌体DNA的结合体，运载能力最高。在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。12/29/202448中山大学药学院张革（1）质粒（plasmid）载体

质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。12/29/202449中山大学药学院张革质粒的生物学特性：1）质粒DNA的构型：SC型：共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型：开环DNA（ocDNA）L型：线性DNA（cDNA）12/29/202450中山大学药学院张革作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因(Ori)选择性记号(Amp,Kana)多克隆位点(MCS)12/29/202451中山大学药学院张革12/29/202452中山大学药学院张革12/29/202453中山大学药学院张革12/29/202454中山大学药学院张革（三）目的基因常用制备方法1.化学合成法

较短的基因<100bp

大片段怎么合成？1977年，加拿大Itakara将人工合成的生长激素释放因子基因在E.coli中表达，这是首次高等生物基因通过基因工程高效表达并产业化。干扰素、人胰岛素、加压素等的产业化生产12/29/202455中山大学药学院张革

合成两条基因互补链片断，经退火成为两端黏性末端的DNA片断退火12/29/202456中山大学药学院张革2.PCR法适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法12/29/202457中山大学药学院张革12/29/202458中山大学药学院张革12/29/202459中山大学药学院张革3.基因文库法:基因文库（genelibrary)：是指某一特定生物体全部基因组的克隆集合，包括所有外显子和内含子序列。基因文库的构建：鸟枪法（shotgun)12/29/202460中山大学药学院张革Shotgunlibraty12/29/202461中山大学药学院张革基因文库的应用12/29/202462中山大学药学院张革4.cDNA文库法cDNA（complementaryDNA）为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomicDNA）不同而无内含子；在mRNA存在的3′末端的多A序列的核苷序列，外显子序列、先导序列以及后续序列等。12/29/202463中山大学药学院张革cDNA文库指某生物某发育时期所转录的全部

mRNA，

经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典

cDNA

文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA

加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。12/29/202464中山大学药学院张革(四）载体DNA与目的基因的连接DNA分子体外重组：连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接。形成重组子（recombinant)的过程。1.粘性末端的连接：经双酶切获得粘性末端，用连接酶进行连接2.平头末端的连接：连接效率低，一般采用加尾法、接头法3.连接效率：目的基因与载体DNA的摩尔比大于1

12/29/202465中山大学药学院张革不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。定向克隆12/29/202466中山大学药学院张革问题：如何加入合成接头？12/29/202467中山大学药学院张革12/29/202468中山大学药学院张革EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠ12/29/202469中山大学药学院张革cDNA克隆的过程12/29/202470中山大学药学院张革（五）重组DNA导入宿主细胞宿主细胞：原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌链球菌真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞原核细胞的转化方法：电穿孔转化法化学转化法12/29/202471中山大学药学院张革导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)◆转化(transformation)：以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程.◆转染(transfection):

以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程.12/29/202472中山大学药学院张革表达产物的形式：细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。1.重组DNA导入大肠杆菌12/29/202473中山大学药学院张革氯化钙转化法：在基因克隆技术中，转化(transformation)特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。是利用低温（0℃）和氯化钙（CaCl2）低渗溶液的理化处理使宿主细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态（competence）。

转染法：如果外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入宿主细胞。体外包装是将重组DNA分子与λ噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整具有感染力的λ噬菌体粒子。12/29/202474中山大学药学院张革重组DNA导入酵母酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。12/29/202475中山大学药学院张革酵母电转化法：酵母用山梨醇处理，制备感受态细胞；将线性化DNA、感受态细胞置于电转仪中，通过电击将DNA导入细胞；电击后应立即加入冰冷的山梨醇溶液（是为了修复电击受损的酵母细胞，加入的越快越有利于细胞的恢复）。12/29/202476中山大学药学院张革重组DNA导入链霉菌链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。12/29/202477中山大学药学院张革原生质体转化法：原生质体protoplast：人工条件下用溶菌酶等除去细胞壁后，所留下的部分。用PEG处理原生质体(化学助融剂如PEG加Ca2+）加入DNA。

12/29/202478中山大学药学院张革重组DNA导入哺乳类细胞哺乳动物细胞：由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。显微注射法磷酸钙转染法葡聚糖转染法阳性介质转染法电穿孔法细胞融合法病毒感染法12/29/202479中山大学药学院张革（六）重组子的筛选与鉴定载体遗传标记法抗生素抗性筛选法如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有该抗生素的培养基平板上进行培养，仍可长出菌落。此法缺点是假阳性率高在含有抗生素的培养基中能够生长的抗性细胞内可能存在哪几种类型的载体？12/29/202480中山大学药学院张革12/29/202481中山大学药学院张革互补筛选法采用遗传缺陷型宿主细胞、而重组子含有编码该基因的DNA序列。最常用的为蓝白斑筛选某些载体，如M13噬菌体载体，pUC质粒系列等，它们的载体上都携带lacZ基因一段序列，它编码β-半乳糖苷酶的α肽，而宿主细胞为lacZ△Ml5的突变株。当将上述载体的转化细胞培养在含有x-gal和IPTG平板中，由于基因内互补作用，产生有生物活性的β-半乳糖苷酶，把培养基中的无色的x-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4氯-靛蓝，使菌落呈蓝色：12/29/202482中山大学药学院张革12/29/202483中山大学药学院张革12/29/202484中山大学药学院张革营养缺陷型筛选法用某些物理因素或化学因素处理宿主细胞，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。导入编码某些营养成分基因的载体，可使营养缺陷型细胞在缺少该营养成分的培养基中生长。12/29/202485中山大学药学院张革组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救12/29/202486中山大学药学院张革噬菌斑筛选法：噬菌体成功感染细菌将导致溶菌未插入外来DNA的空载体由于长度过小不能装配成噬菌体颗粒。12/29/202487中山大学药学院张革2.核酸分子杂交法菌落(或噬菌斑)原位杂交(insituhybridization)将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤维滤膜上。翻转此滤膜并置于另一不含菌的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。12/29/202488中山大学药学院张革取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解，释放出DNA。再用碱处理，使DNA变性，经烘烤将变性DNA固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克隆。12/29/202489中山大学药学院张革12/29/202490中山大学药学院张革DNA印迹分析（Southernblotting)通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的DNA分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些DNA分子物质的过程。NorthernBlotting（Northern印迹）

12/29/202491中山大学药学院张革12/29/202492中山大学药学院张革12/29/202493中山大学药学院张革3.限制性酶谱分析法将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体DNA，用1-2种RE酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入DNA片段大小。12/29/202494中山大学药学院张革XhoINotIXhoIMEKK11200bpPromoter400bppUC-mT2700bpColony12313100bp1200bp400bp2700bpXhoIcuttingXhoI+NotIcutting1200bppUC-mT/pLMP1-MEKK14300bp实例12/29/202495中山大学药学院张革4.DNA序列测定为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。12/29/202496中山大学药学院张革5.目的基因表达产物测定法例：免疫斑点测定法如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。此法实验操作极似菌落(或噬菌斑)原位杂交。将平板上的克隆转移到滤膜上，处理滤膜使菌体裂解，释放出蛋白质，固定于滤膜上，加入标记抗体。如果抗体用放射性同位素标记，则免疫反应后进行自显影；若加入的抗体用酶偶联(酶标)，那么此酶就可将无色底物水解成有色产物。12/29/202497中山大学药学院张革基因载体目的基因

质粒噬菌体病毒

PCRcDNA

人工合成基因文库限制性内切酶有切口的载体有切口的目的基因DNA连接酶

重组体

转化转染体外包装带重组体的宿主细胞表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目的基因的表达12/29/202498中山大学药学院张革

以质粒为载体的DNA

克隆过程12/29/202499中山大学药学院张革（七）原核细胞表达的特点及选择外源基因表达的调控元件启动子:是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的一段序列plac启动子:最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子ptrc启动子:是trp启动子和lac启动子的拼合启动子λPL:λ噬菌体的转录启动子PL,该启动子受控于λ噬菌体cI基因产物T7启动子:是当今大肠杆菌表达系统的主流12/29/2024100中山大学药学院张革核糖体结合位点(rbs):原核微生物的mRNA结合核糖体的序列称为SD序列(shine-dalgarnosequence)。SD序列位于AUG上游3-11个核苷酸处的一段3-9个碱基的DNA序列,该序列和核糖体蛋白S1与16SrRNA的3′端互补，形成核糖体-mRNA复合体，共同起始蛋白质的合成。SD序列与AUC之间的距离可直接影响表达效率。终止子：是基因3‘端可被RNA聚合酶识别并停止转录功能的特定序列。12/29/2024101中山大学药学院张革2.外源基因在大肠杆菌中的表达形式大肠杆菌被内膜、外膜分隔为胞内、周质、胞外三个区域表达可定位于胞内、周质、胞外胞内表达率高，但易行成包涵体12/29/2024102中山大学药学院张革胞内表达的两种方式非融合蛋白的胞内表达表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌或噬菌体的启动子-细菌的RBS-真核基因的AUG-结构基因-*。易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应StopATGSDP目的基因12/29/2024103中山大学药学院张革非融合型表达载体

PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因主要元件：强启动子，SD，ATG：第一个密码子ATGPSDTAAMCS12/29/2024104中山大学药学院张革12/29/2024105中山大学药学院张革融合型表达载体

PSDForeignDNA融合型表达载体

C端融合基因ATGTAA

N端融合基因ATGTAA12/29/2024106中山大学药学院张革融合蛋白的表达融合蛋白氨基端是原核序列羧基端是真核序列；优点：操作简便蛋白质在菌体内比较稳定易高效表达；StopATGSDP目的基因tagtag12/29/2024107中山大学药学院张革Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相载体（1）融合型载体----pGEX系列12/29/2024108中山大学药学院张革12/29/2024109中山大学药学院张革1.小分子量或易降解，或对宿主有毒的目的蛋白的表达2.GST标签纯化树脂GSTResin纯化12/29/2024110中山大学药学院张革（2）融合型载体----His融合1.His-Tag分子量小，无抗原性2.Ni-NTAResin

(His标签纯化树脂)亲和纯化12/29/2024111中山大学药学院张革

pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。该质粒在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，1.可用亲和层析(SPA)。简化下游工艺。2.溴化氢裂解，不用酶（3）融合型载体----IgG融合12/29/2024112中山大学药学院张革融合表达质粒pBG-2的结构12/29/2024113中山大学药学院张革分泌型表达：将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时，被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割。12/29/2024114中山大学药学院张革目标蛋白在周质空间中表达的优点大肠杆菌周质空间中自身蛋白质的数量约为100种，只占菌体总蛋白数量的4%。蛋白水解酶的含量与在细胞质中相比也少得多，因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分离纯化和减少蛋白水解酶的降解。目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的产生。周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好折叠，维持正确的构象。12/29/2024115中山大学药学院张革3.大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素外源基因密码子的使用稀有密码子：AGA、AGC、ATA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC共八种采用稀有密码子会导致：表达效率低下、错配率高可采用定点突变的策略进行同义突变12/29/2024116中山大学药学院张革mRNA的结构：mRNA的一级结构对翻译效率的影响采用偏好密码子（增加T、A含量）大肠杆菌的核酸酶系统能专一性地识别外源DNA或RNA并对其进行降解。mRNA的二级结构对翻译效率的影响发夹的形成的双重作用—即可保护mRNA不被降解、但阻碍翻译的起始和延伸12/29/2024117中山大学药学院张革表达载体的选择（1）载体能够独立的复制；（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；（3）具有很强的启动子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因；（4）具有抑制子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终止子；（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。12/29/2024118中山大学药学院张革外源蛋白的稳定性组建融合蛋白；利用信号肽，分泌型表达；特异性突变；位点特异突变，改变二硫键位置；蛋白酶缺陷型宿主12/29/2024119中山大学药学院张革（八）真核细胞表达的特点及选择由于：原核表达系统缺乏蛋白翻译后加工修饰多以包涵体形式存在外源蛋白在原核生物中不稳定，易被降