《海水 总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌和肠球菌的测定 酶底物法编制说明》

《海水总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌

和肠球菌的测定酶底物法》

（征求意见稿）

编制说明

一、工作简况

（一）任务来源

《海水总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌和肠球菌的测

定酶底物法》的制定列入《自然资源部办公厅关于印发2022年度自

然资源标准制修订工作计划》（自然资办发〔2022〕39号），项目编

号为：202222007。

本标准由中华人民共和国自然资源部提出，全国海洋标准化技术

委员会（SAC/TC283）归口。文件对总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠

埃希氏菌和肠球菌这四类菌群的采样方法、检测技术要求、结果与计

算、质量控制等环节进行了规定。

本文件适用于海水中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌和

肠球菌的酶底物法测定。

（二）协作单位

本文件制定的承担单位为自然资源部东海生态中心，隶属于自然

资源部东海局，是具有独立法人资格、CMA资质的公益性事业单位；

拥有国家海洋局近岸海域生态环境重点实验室和海域管理技术重点

实验室；为自然资源部海洋生态监测与修复重点实验室、太平洋学会

东海分会等机构的挂靠单位。

本标准的制修订共有两家协作单位，分别为自然资源部温州海洋

3

中心、上海海洋大学，两家单位均长期从事港口、近岸海域、海洋环

境中微生物监测检测工作，拥有开展本项目的能力和资质，设备齐全

完善，技术人员均长期在一线从事检测、研究海洋微生物工作，专业

知识扎实、技术过关。

（三）主要工作过程

文件编制组广泛搜集整理国内外相关菌群检测方法及技术资料，

结合实际业务工作情况，比较各种方法的优缺点，组织专家咨询研讨。

在听取多方及相关业务单位意见和建议后，在草案稿的基础上修改形

成本文件。

2020年6月，申报自然资源部标准制修订行业标准预研究计划。

2020年10月~2022年2月，依据《自然资源部办公厅关于印发

2020年度自然资源标准制修订工作计划的通知》（自然资办发〔2020〕

43号），立项成功。在预研期间，完成初稿的编写。

2022年3月，申报自然资源部标准制修订行业标准计划。

2022年9月，依据《自然资源部办公厅关于印发2022年度自然

资源标准制修订工作计划的通知》（自然资办发〔2022〕39号），立

项成功。

2022年10月，自然资源部东海生态中心作为承担单位成立了《海

水总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌和肠球菌的测定酶底物

法》的标准制修订工作组，确定了项目的总体目标，构建了标准制修

订工作的思路和框架，并做了人员分工安排。

2022年11月，自然资源部东海生态中心在上海组织召开标准的

项目启动会。来自东海生态中心、上海海洋大学、温州海洋中心、上

海市生物医药技术研究院和自然资源部第二海洋研究所等5家单位9

位代表参加本次会议，会议成立了标准起草工作组、制定了工作方案。

4

2022年12月~2023年5月，标准起草工作组在初稿的基础上完

成了征求意见稿的编写。

2023年5月~10月，标准起草工作组进行了数据的汇总和整理分

析工作，编制《海水总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌和肠

球菌的测定酶底物法》（征求意见稿）编制说明。

2023年7月~10月，标准起草工作组组织了7家具有资质的实验

室进行方法验证，于2023年10月收回所有的验证报告，参与单位包

括温州大学（生命与环境科学学院）、浙江省海洋水产养殖研究所（浙

江省海洋渔业环境与生物安全检验监测中心）、自然资源部宁德海洋

中心、自然资源部南通海洋中心、广东省珠海生态环境监测站、海南

省生态环境监测中心和河北省秦皇岛生态环境监测中心等。

2023年11月，标准起草工作组将标准征求意见稿、编制说明和

验证报告等材料送有关单位广泛征求意见，线上线下同时进行。

（四）标准主要起草人及其所做的工作

为确保文件编制工作有效推进，标准起草工作组根据项目任务要

求，以及启动会中的工作安排，完成了编制任务分解。本文件编制由

长期从事海洋微生物检测的专业技术人员组成。

启动会之后，相关编制人员开展新资料搜集，并对原有的草案进

行修改。在编制过程中，海标委的吴春芳老师（指导老师）对本文件

草案稿、征求意见稿以及编制说明进行了持续的指导，包括工作进展

跟踪，以及对文件形成提供了规范性的指导意见。

袁一鸣（自然资源部东海生态中心）：第一起草人，负责调查研

究、技术路线设计、水样检测实验及数据整理和分析、标准草案的起

草和修改、编制说明和实验验证报告编写等；

黄辉（自然资源部温州海洋中心）：主要起草人，负责站位布设、

5

海水采集、水样检测实验、参与标准草案的起草、修改,编制说明的

编写；

邓邦平（自然资源部东海生态中心）：负责会议组织、参与编制

说明的编写；

邵力（自然资源部东海生态中心）：负责海水采集、参与标准和

编制说明的编写；

王肖波（自然资源部东海生态中心）：负责海水采集、水样检测

实验；

王宇坛（自然资源部东海生态中心）：负责海水采集、水样检测

实验；

何海生（自然资源部东海生态中心）：负责海水采集、水样检测

实验；

吴慧仙（上海海洋大学）：负责海水水样检测实验及数据整理。

王琼（上海海洋大学）：负责海水水样检测实验及数据整理。

二、标准编制原则和确定主要内容的论据

（一）标准编制原则

本标准在结构与内容编排上根据GB/T1.1-2020《标准化工作导

则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》规定进行。

本标准在制定过程中，依据国家有关政策、法令和法规，在确定

各项指标时，综合考虑了国内外相关检测标准和方法，力求将标准制

定与技术创新结合，以期到达预期的社会效益。

（1）方法准确可靠，满足该方法流程中各环节特性指标的要求，

具有较好的准确性、精密性和稳定性。

（2）方法具等效性，满足海洋行业相关工作内容的要求，能适

应不同海水中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌和肠球菌的测

6

定。

（3）方法普遍适用性，易于推广，需操作简便，省时省力，尤

其能满足外业就地或船上作业的需求。

（二）确定主要内容的论据

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化

文件的结构和起草规则》的要求和规定编写，在文件框架、结构和内

容等方面符合标准化工作导则的要求。标准起草工作组研究了行业内

相关微生物检测方法和技术等资料，结合国内、国际总大肠菌群、粪

大肠菌群、大肠埃希氏菌和肠球菌这四种菌群相关标准情况，听取了

专家意见和建议，修改、完善了初稿文件，最终形成征求意见稿。

样品采集参照GB17378.7《海洋监测规范第7部分：近海污

染生态调查和生物监测》中的微生物海水样品采集进行操作。

总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌和肠球菌的培养温度，

参照《海洋监测规范第7部分：近海污染生态调查和生物监测》（GB

17378.7）中9.1发酵法、《水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃

希氏菌的测定酶底物法》（HJ1001-2018），并结合（ISO9308-2：

2012）、美国《水和废水检验的标准方法》24版9223部分，以及相

关肠球菌地标进行确定。

（三）具体内容的确定

文件共分11章。主要内容包括：前言；第1章范围；第2章规

范性引用文件；第3章术语和定义；第4章方法原理；第5章试

剂和材料；第6章仪器和设备；第7章样品采集；第8章样品检

测；第9章结果与计算；第10章质量保证和控制；第11章废物

处理。详细内容见文件。

三、主要试验(或验证)的分析、综述报告、技术经济论

7

证及预期的经济效果

（一）主要试验（或验证）的分析

（1）总体情况介绍

2018年~2022年开展标准相关的研究工作。比较研究了相关标

准，以及文献资料的调研，剖析国内海水中总大肠菌群、粪大肠菌群、

大肠埃希氏菌和肠球菌的检测技术特点、存在问题。同时结合海洋微

生物检测实际情况，提出了本文件制定的必要性，完成了文件草案的

编写。

鉴于海水成分的复杂性和特殊性，本文件在制修订前的实验数

据，主要通过结合不同盐度分布情况（2021年7月~8月），选取不同

盐度海域海水进行实验，并积累了一定的数据。

同时，对我国北海和南海的海水用酶底物法和多管发酵法同时进

行总大肠菌群和粪大肠菌群的检测，两种方法无显著性差异，证明了

该方法在全国沿海的可适用性。

表3-1已积累不同海域微生物数据情况统计表

海域功能区类型盐度备注

保留区、工业与城镇用海区、特殊利

0~10瓯江航道区

用区

河口海洋保护区、港口航运区、矿产嵊泗

东海10~20

与能源区小洋山

象山港

农渔业区、旅游休闲娱乐区20~30

鹦鹉洲湿地

黑石礁、星海

湾、星海公园、

北海旅游休闲娱乐区

付家庄、凌水

湾

南海旅游休闲娱乐区汕尾

8

图3-12021年7月~8月长江口生态功能区划图

（2）数据分析与比对

基于上述情况，对东海不同功能区海域，以及南、北海域海水进

行了检测，其中总大肠菌群和粪大肠菌群使用酶底物法和多管发酵法

两种方法进行比对，同时对数据进行统计和分析。

表3-2酶底物法和多管发酵法检测总大肠菌群的结果

序号酶底物法（MPN/L）多管发酵法（MPN/L)

1185092000

2187054000

32950160000

4211054000

5199035000

610390160000

7771092000

8141362400

9173294900

10129973500

1181642400

12155311300

136131800

146867200

157701900

163448200

175172200

9

1881642400

19155311300

20129973500

21141362400

22173294900

236131800

247701900

256867200

265172200

273448200

2896090

291001700

将酶底物法与多管发酵法的总大肠菌群结果进行对数转换（lg），

利用统计学分析软件（SPSS）对转换后的两组数据进行配对t检验，

统计结果显示P=0.140>0.05，说明在0.05的显著性水平上，酶底物

法与多管发酵法两种检测方法的检测结果无差异。

表3-3酶底物法和多管发酵法检测总大肠菌群的结果分析

均值的标差分的95%置信区间

均值标准差tdfSig.(双侧)

准误差下限上限

酶底物法lg

和多管发酵-0.312411.106280.20543-1.08390.733221.521280.140

法lg

表3-4酶底物法和多管发酵法检测粪大肠菌群的结果

序号酶底物法（MPN/L）多管发酵法（MPN/L）

154754100

281649100

348842300

472706000

564885000

657946000

7980410000

830762000

972701300

1064885000

1148845300

1254756100

10

1381646000

1557947000

1630763000

17740700

1863020

1920020

2031080

2110020

22100700

2310020

将酶底物法与多管发酵法的粪大肠菌群结果进行对数转换（lg），

利用统计学分析软件（SPSS）对转换后的两组数据进行配对t检验，

统计结果显示P=0.140>0.05，说明在0.05的显著性水平上，酶底物

法与多管发酵法两种检测方法的检测结果无差异。

表3-5酶底物法和多管发酵法检测粪大肠菌群的结果分析

均值的标差分的95%置信区间

均值标准差tdfSig.(双侧)

准误差下限上限

酶底物法lg

和多管发酵-0.382500.874550.19556-0.791800.026801.956190.065

法lg

（3）定量阳性质控结果分析

选用NSI大肠菌群定量阳性质控（批号：200414、040717）、肠

球菌定量质控（批号：200327、210224），使用酶底物法对其进行检

测，所有结果均在可接受范围之内。

表3-6定量阳性质控信息

类型溯源批号真值（MPN/L）可接受范围（MPN/L）

总大肠菌群：13782±1620总大肠菌群：2810-68370

大肠菌群

NCTC9001200414大肠埃希氏菌：8770±1040大肠埃希氏菌：1920-42370

定量质控

粪大肠菌群：11070±1930粪大肠菌群：1860-70190

大肠菌群

NCTC9001040717粪大肠菌群：1220±150粪大肠菌群：210-7740

定量质控

肠球菌定

NCTC775200327肠球菌：10200±930肠球菌：2880-13400

量质控

11

肠球菌定

NCTC775210224肠球菌：18130±3320肠球菌：8810-40970

量质控

表3-7酶底物法检测定量阳性质控中总大肠菌群、大肠埃希氏

菌、粪大肠菌群和肠球菌结果

序号批号项目结果（MPN/L）

1200414总大肠菌群12033

2200414总大肠菌群14136

3200414总大肠菌群14136

4200414总大肠菌群9606

5200414总大肠菌群15531

6200414总大肠菌群11199

7200414大肠埃希氏菌4884

8200414大肠埃希氏菌8164

9200414大肠埃希氏菌9804

10200414大肠埃希氏菌6893

11200414大肠埃希氏菌11199

12200414大肠埃希氏菌8664

13200414粪大肠菌群12997

14200414粪大肠菌群15531

15040717粪大肠菌群1483

16200327肠球菌8164

17200327肠球菌6867

18200327肠球菌7701

19210224肠球菌14136

20210224肠球菌14136

21210224肠球菌12997

（4）阴性质控结果分析

选用NSI铜绿假单胞菌定量质控（批号：200721，NCTC12951）

作为总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群的阴性质控；选用NSI

大肠埃希氏菌定量质控（批号:200804，NCTC9001）作为肠球菌的阴

性质控，使用酶底物法对其进行检测，所有检测结果均为阴性。

表3-8酶底物法检测阴性质控中总大肠菌群、大肠埃希氏菌、

12

粪大肠菌群和肠球菌结果

序号批号项目结果（MPN/L）

1200721总大肠菌群未检出

2200721总大肠菌群未检出

3200721总大肠菌群未检出

4200721大肠埃希氏菌未检出

5200721大肠埃希氏菌未检出

6200721大肠埃希氏菌未检出

7200721粪大肠菌群未检出

8200721粪大肠菌群未检出

9200721粪大肠菌群未检出

10200804肠球菌未检出

11200804肠球菌未检出

12200804肠球菌未检出

（5）实际水样精密度分析

采用酶底物法进行总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群和肠

球菌的分析结果，根据《近岸海域环境监测技术规范第六部分近岸

海域生物监测》（HJ442.6-2020）进行微生物平行双样的精密度分析，

经计算可得，总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群和肠球菌的精

密度判断值分别为0.4793、0.2486、0.3207和0.3255，日常监测平行

双样结果的对数值差距Rlg均小于精密度判断值，故酶底物法检测总

大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群和肠球菌符合精密度要求。

表3-9总大肠菌群的精密度分析

双样试验结果水样试验结果的对数值对数值的差距

水样号精密度判断

n1n2Lgn1Lgn2|Lgn1-Lgn2|

135.024.01.54411.38020.1639可接受

24.14.10.61280.61280.0000可接受

371.266.31.85251.82150.0310可接受

46.23.10.79240.49140.3010可接受

531.325.91.49551.41330.0822可接受

65.22.00.71600.30100.4150可接受

76.313.40.79931.12710.3278可接受

13

82.01.00.30100.00000.3010可接受

947.120.31.67301.30750.3655可接受

108.63.10.93450.49140.4431可接受

1179.876.71.90201.88480.0172可接受

1213.58.61.13030.93450.1958可接受

1318.518.71.26721.27180.0047可接受

1429.524.31.46981.38560.0842可接受

151046.91299.73.01993.11380.0939可接受

1621.119.91.32431.29890.0254可接受

17261.3172.52.41712.23680.1804可接受

18103.977.12.01661.88710.1296可接受

191413.61732.93.15033.23880.0884可接受

201299.7816.43.11382.91190.2019可接受

211553.12419.63.19123.38370.1925可接受

22613.1686.72.78752.83680.0492可接受

231299.7770.13.11382.88650.2273可接受

24344.8613.12.53762.78750.2500可接受

25517.2648.82.71372.81210.0985可接受

261553.11299.73.19123.11380.0774可接受

271413.61732.93.15033.23880.0884可接受

282419.62419.63.38373.38370.0000可接受

29613.11299.72.78753.11380.3263可接受

30770.1686.72.88652.83680.0498可接受

31517.2648.82.71372.81210.0985可接受

32344.8613.12.53762.78750.2500可接受

333.01.00.47710.00000.4771可接受

341.01.00.00000.00000.0000可接受

352.01.00.30100.00000.3010可接受

361.01.00.00000.00000.0000可接受

376.36.30.79930.79930.0000可接受

382.01.00.30100.00000.3010可接受

391.02.00.00000.30100.3010可接受

401.01.00.00000.00000.0000可接受

411.01.00.00000.00000.0000可接受

421.01.00.00000.00000.0000可接受

431.01.00.00000.00000.0000可接受

441.01.00.00000.00000.0000可接受

451.01.00.00000.00000.0000可接受

461.03.00.00000.47710.4771可接受

479.710.80.98681.03340.0467可接受

481.01.00.00000.00000.0000可接受

14

491.01.00.00000.00000.0000可接受

506.33.10.79930.49140.3080可接受

5117.19.61.23300.98230.2507可接受

521.01.00.00000.00000.0000可接受

表3-10大肠埃希氏菌的精密度分析

双样试验结果水样试验结果的对数值对数值的差距

水样号精密度判断

n1n2Lgn1Lgn2|Lgn1-Lgn2|

14.15.20.61280.71600.1032可接受

21.01.00.00000.00000.0000可接受

32.03.00.30100.47710.1761可接受

41.01.00.00000.00000.0000可接受

53.15.20.49140.71600.2246可接受

61.01.00.00000.00000.0000可接受

71.01.00.00000.00000.0000可接受

84.15.20.61280.71600.1032可接受

92.03.00.30100.47710.1761可接受

101.01.00.00000.00000.0000可接受

112.03.00.30100.47710.1761可接受

121.01.00.00000.00000.0000可接受

134.15.20.61280.71600.1032可接受

141.01.00.00000.00000.0000可接受

151.01.00.00000.00000.0000可接受

164.15.20.61280.71600.1032可接受

175.23.00.71600.47710.2389可接受

181.01.00.00000.00000.0000可接受

194.13.00.61280.47710.1357可接受

202.01.90.30100.27880.0223可接受

211.01.00.00000.00000.0000可接受

222.03.00.30100.47710.1761可接受

231.01.00.00000.00000.0000可接受

241.01.00.00000.00000.0000可接受

252.03.00.30100.47710.1761可接受

263.03.00.47710.47710.0000可接受

271.01.00.00000.00000.0000可接受

283.04.10.47710.61280.1357可接受

292.03.00.30100.47710.1761可接受

301.01.00.00000.00000.0000可接受

311.01.00.00000.00000.0000可接受

15

321.01.00.00000.00000.0000可接受

331.01.00.00000.00000.0000可接受

341.01.00.00000.00000.0000可接受

351.01.00.00000.00000.0000可接受

362.03.00.30100.47710.1761可接受

371.01.00.00000.00000.0000可接受

385.23.10.71600.49140.2246可接受

392.03.10.30100.49140.1903可接受

403.02.00.47710.30100.1761可接受

411.01.00.00000.00000.0000可接受

421.01.00.00000.00000.0000可接受

431.01.00.00000.00000.0000可接受

445.23.10.71600.49140.2246可接受

451.01.00.00000.00000.0000可接受

463.02.00.47710.30100.1761可接受

473.04.10.47710.61280.1357可接受

481.01.00.00000.00000.0000可接受

491.01.00.00000.00000.0000可接受

503.04.10.47710.61280.1357可接受

515.23.00.71600.47710.2389可接受

522.03.00.30100.47710.1761可接受

531.01.00.00000.00000.0000可接受

541.01.00.00000.00000.0000可接受

551.01.00.00000.00000.0000可接受

562.03.00.30100.47710.1761可接受

表3-11粪大肠菌群的精密度分析

双样试验结果水样试验结果的对数值对数值的差距

水样号精密度判断