免疫组化2-基本原理课件

免疫组织化学技术免疫组化2-基本原理

抗原＋抗体（特异性）＋标记物，原位显示组织或细胞内抗原的一门技术。免疫组化2-基本原理根据抗体标记物不同：酶---免疫酶组织化学荧光素---免疫荧光组化胶体金---免疫胶体金组化高亲和力物质---亲和免疫组化免疫组化2-基本原理其中，免疫酶组织化学应用广泛以其为例，掌握免疫组化基本原理免疫酶组化特点：信号定位准确标本可长期保存阳性标记与病变关系方法简便，易推广免疫组化2-基本原理酶选择标准：★该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。★酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。

★酶易于纯化，获得纯制品。★酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。★酶在PH中性液内较稳定。★组织中不应存在与底物作用的内源性酶。免疫组化2-基本原理符合上述条件：

辣根过氧化物酶---HRP

硷性磷酸酶---AKP

葡萄糖氧化酶---GOD免疫组化2-基本原理（一）辣根过氧化物酶（HRP）★分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位★稳定，易获得较高纯度酶★具有较高活性及特异性★可溶性佳，生成的产物不扩散★组织中内源性酶较少★可作用于多种底物，产生不同颜色★HRP穿透力强，易进入细胞内免疫组化2-基本原理HRP的底物：低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。HRP显色反应：

HRP＋H2O2HRP＋H2O＋电子供体（氧化型）电子供体电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。免疫组化2-基本原理HRP常用的电子供体：●3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色●氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。●4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久保存●3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB)～黄色免疫组化2-基本原理

（二）硷性磷酸酶（AKP）

从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取●组织穿透能力较弱●内源性AKP较高●左旋咪唑具有抑制作用免疫组化2-基本原理AKP底物：AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐

偶联试剂：固兰BB～蓝色固红TR～红色免疫组化2-基本原理

（三）葡萄糖氧化酶（GOD）

底物为葡萄糖，终产物稳定●体内无内源性GOD●分子量大，穿透力较弱免疫组化2-基本原理

第一节基本原理

免疫组化2-基本原理

酶标记抗体法（EnzaymeLabelledantibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。一、酶标记抗体法免疫组化2-基本原理组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法（一）直接法原理：HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原---抗体●HRP复合物免疫组化2-基本原理步骤：一步完成优点：简便、省时特异性强，非特异染色轻缺点：敏感性差一种标记抗体只能检测一种抗原免疫组化2-基本原理组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法（二）间接法原理：HRP标记在第二抗体上，抗原---特异性抗体---第二抗体●HRP复合物免疫组化2-基本原理优点：较直接法敏感性高

一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原缺点：

较直接法费时非特异性染色稍重

步骤：二步法免疫组化2-基本原理●制备抗酶抗体●制备PAP复合物免疫组化2-基本原理酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）HRP二、酶桥法原理：HRP标记在抗酶抗体（三抗）上，抗原---特异性抗体---第二抗体---第三抗体●HRP复合物一抗、三抗有何关系？免疫组化2-基本原理优点：与酶标记抗体法相比，敏感性高（酶与三抗通过抗原-抗体反应结合，避免直接标记引起两者活性降低）缺点：

较费时

步骤：四步法免疫组化2-基本原理一、PAP法原理：抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP复合物免疫组化2-基本原理组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP三、PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法）原理：与酶桥法相似，不同之处是将酶与三抗制备成PAP复合物。抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗）---PAP复合物免疫组化2-基本原理优点：敏感性较高背景染色较轻局限：特异性抗体与PAP必须为同一种属动物

步骤：三步法免疫组化2-基本原理APAAP法（碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物法）原理：抗原---特异抗体---二抗---APAAP复合物免疫组化2-基本原理优点：非特异背景较轻，不受内源性酶的干扰

缺点：产物易溶于有机溶剂步骤：三步法免疫组化2-基本原理组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP四、双PAP法原理：在PAP的基础上再重复第二抗体和PAP复合物抗原---特异性抗体---二抗（桥抗）---PAP---二抗---PAP复合物免疫组化2-基本原理步骤：五步法

优点：敏感性较高缺点：步骤多，费时

非特异性背景重免疫组化2-基本原理Avidin---一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成Biotin---小分子维生素Avidin和Biotin具有较高亲和力，比普通抗原抗体亲和力高百万倍以上五、亲和免疫组化免疫组化2-基本原理组织抗原第一抗体第二抗体HRP生物素亲和素原理：酶标记Biotin形成酶素化

Biotin（一）ABC法

(Avidin-Biotin–peroxidase-Complexmethod)

酶素化Biotin＋Avidin---ABC复合物抗原---特异抗体---Biotin标记二抗---Avidin●Biotin●HRP免疫组化2-基本原理步骤：三步法优点：敏感性较高特异性强应用范围广缺点：某些脏器存在内源性生物素干扰

Avidin与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应

免疫组化2-基本原理（二）SABC法（StreptavidinbiotinPeroxidaseComplex）

比较亲和素，链霉亲和素造成的背景着色浅

SABC法已代替ABC法免疫组化2-基本原理

（三）LSAB法（

LabelledStreptavidinBiotinMethod）---又称链霉亲和素-过氧化物酶法（SP法）原理：

●Biotin标记第二抗体●HRP标记Avidin抗原---特异性抗体---Biotin标记第二抗体---Avidin●HRP复合物免疫组化2-基本原理步骤：三步法优点：敏感性高特异性强，背景浅淡方法简便

免疫组化2-基本原理六、多聚合物酶法免疫组化2-基本原理组织抗原一抗HRP多聚骨架（一）Epos法（Enhancedpolymerone-stepstaining）原理：采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架，将特异性抗体和HRP，同时标记在多聚合物分子上，形成HRP---多聚合物---特异性抗体。免疫组化2-基本原理步骤：一步法优点：快速，简便，特异性强，敏感性高缺点：商品化种类不全，

价格昂贵免疫组化2-基本原理组织抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步第二步（二）EnVision法（Enhan