T-LTIA 25-2024 鱼肉中孔雀石绿残留物的快速检测表面增强拉曼光谱法

ICS67.120.30CCSB50LTIARapiddetectionofmalachitegreenresiduesinfishIT/LTIA25—2024前言 II III 2规范性引用文件 3术语和定义 4方法原理 5试剂与材料 6仪器和设备 7试样的制备与保存 7.1试样的制备 27.2试样的保存 2 8.1提取 38.2净化 38.3测定 38.4结果的判定 38.5复检和确证 39方法的灵敏度和准确性验证 9.1灵敏度 49.2准确性验证 410检测报告 附录A（资料性）孔雀石绿拉曼光谱示例 A.1孔雀石绿的拉曼光谱 A.2含有不同浓度孔雀石绿的鱼肉样品的表面增强拉曼光谱 参考文献 IIT/LTIA25—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由深圳市生命科技产学研资联盟提出并归口。本文件起草单位：华测检测认证集团股份有限公司、江南大学、上海交通大学、深圳华大海洋科技有限公司、深圳市生命科技产学研资联盟本文件主要起草人：李家欣、邱险辉、尹丽丽、谢云飞、吴蕴雯、游欣欣、孙莹莹、刘文秋、李陶莎、武庆超IIIT/LTIA25—2024孔雀石绿在水产养殖业中被广泛用于治疗鱼类的真菌和寄生虫感染。然而，由于其潜在的致癌和诱变性，其使用引起了人们的担忧。摄入孔雀石绿污染的鱼可能会导致各种健康问题，包括肝损伤和肿瘤形成。因此，包括欧盟和美国在内的多个国家已经禁止或限制了在水产养殖中使用孔雀石绿。尽管有这些规定，孔雀石绿在水产养殖中的非法使用仍然是一个持续的问题，特别是在那些监管执行可能较弱的发展中国家。孔雀石绿在鱼和鱼产品中的残留对消费者健康和环境构成了重大风险。因此，开发准确、快速和可靠的检测方法以确保鱼产品的安全并保护公共健康是至关重要的。表面增强拉曼光谱（SERS）是一种先进的分析技术，可以以高灵敏度和选择性检测化学化合物的微量。这种方法依赖于通过纳米结构表面或纳米粒子的存在来增强拉曼散射信号，从而可以检测到微量浓度的目标物质。在孔雀石绿检测的背景下，SERS相比传统的方法，如高效液相色谱（HPLC）和酶联免疫吸附测定（ELISA提供了几个优势。这些优点包括更快的分析时间，更高的灵敏度，和更低的检测限度。此外，SERS可以轻松集成到便携式设备中，为水产养殖设施现场分析提供了多功能和用户友好的工具。制定一个使用SERS方法检测鱼类中孔雀石绿残留的团体标准对于各方面检测标准的协调，确保结果的可靠性以及促进全球贸易是至关重要的。它将为实验室、监管机构和水产养殖业提供清晰的指导，从而改善质量控制，提高消费者信心，减少健康风险。此外，采用这个标准将鼓励进一步的研究和开发基于SERS的检测方法，推进监测水产养殖及其他领域有害物质的解决方案。本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及5.2中相应内容的相关专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。表1中列出的专利权人持有本文件涉及的专利。表1持有本文件涉及的专利的专利权人相关信息专利持有人地址华测检测认证集团股份有限公司深圳市宝安区新安街道兴东社区华测检测大楼江南大学江苏省无锡市蠡湖大道1800号请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。1T/LTIA25—2024鱼肉中孔雀石绿残留物的快速检测表面增强拉曼光谱法本文件规定了采用表面增强拉曼光谱法快速测定鱼肉中孔雀石绿残留量的方法。本文件适用于鱼肉中孔雀石绿的表面增强拉曼光谱快速筛查检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法3术语和定义3.1表面增强剂surfaceenhancer能够显著增强吸附在其表面的分子的拉曼散射信号的纳米结构材料。3.2空白样品blanksamples不含目标分析物，且组成及物理化学性质与检测样品相同或充分相似的样品。[来源：GB/T32467-2015，有修改]4方法原理试样中的孔雀石绿残留用乙腈提取，经中性氧化铝柱净化后，用表面增强拉曼检测仪测定。孔雀石绿分子与表面增强剂混合后，目标分子吸附在表面增强纳米粒子上从而增强其拉曼散射信号。表面增强拉曼检测仪可通过自动识别特征峰对孔雀石绿进行定性检测。5试剂与材料本方法所用水为GB/T6682规定的三级水。5.1.1乙腈（CH3CN分析纯。5.1.2醋酸铵（CH3COONH4分析纯。5.1.3无机盐混凝剂：1mol/L氯化钠水溶液，或其他相当的无机盐溶液。5.1.4醋酸铵溶液（5mmol/L称取0.385g醋酸铵，用水溶解，定容至1000mL，现用现配。5.2标准品5.2.1孔雀石绿标准品（CAS569-64-2纯度≥99.0%。2T/LTIA25—20245.3标准溶液配制5.3.1孔雀石绿标准储备溶液（50μg/mL）称取5.0mg（精确至0.01mg）孔雀石绿标准品于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，-18℃避光保存，有效期3个月。5.3.2孔雀石绿标准中间溶液（0.5μg/mL）吸取1.00mL孔雀石绿标准储备溶液于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，-18℃避光保存，5.3.3孔雀石绿标准工作溶液（5μg/L）吸取1.00mL孔雀石绿标准中间溶液于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，现用现配。5.4材料5.4.1表面增强剂：纳米金-三聚氰胺海绵[1]，纳米金，纳米银，或其他适用。5.4.3有机0.2μm滤膜。6仪器和设备6.1表面增强拉曼光谱仪。6.3离心机：转速=4000r/min。6.4涡旋仪。6.5匀浆机。6.6超声波清洗仪。6.7旋转蒸发仪。6.8KD浓缩瓶：25mL。7试样的制备与保存7.1试样的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织的可食部分，绞碎，并使均质。a)取均质后的供试样品，作为供试试样；b)取均质后的空白样品，作为空白试样；7.2试样的保存-18℃以下保存。3T/LTIA25—20248步骤称取约5.0g(±0.01g)的试样于50mL离心管中。加入11mL乙腈，超声振荡提取2min，涡旋30s，4000r/min离心5min，将上清液收集到25mL比色管中。残渣再加乙腈11mL，重复提取一次，合并上清液。用乙腈定容至25mL，混匀备用。8.2净化移取5.0mL上述提取液至活化的中性氧化铝柱上，用KD浓缩瓶接收滤液。用4.0mL乙腈清洗中性氧化铝柱并收集所有滤液。45℃旋转蒸发至近干，用乙腈将残液定容1mL，超声震荡5min。加8.3测定8.3.1表面增强拉曼光谱仪参考条件数据采集时间≥2s。响应范围300cm-1~1800cm-1，或大于该响应范围。8.3.2样品的测定将待测溶液、表面增强剂和无机盐混凝剂按5:1:1的比例加入样品池中，混合后进行拉曼检测。曝光时间为30s。8.3.3空白试样的测定称取5.0g空白试样，按照8.1和8.2步骤与样品同法操作，拉曼光谱仪检测。8.3.4加标试样的测定称取5.0g空白试样于离心管中，加入5mL孔雀石绿标准工作溶液（5.3.3按照8.1和8.2步骤与样品同法操作，表面增强拉曼光谱仪检测。8.4结果的判定征拉曼光谱，对样品中孔雀石绿的含量进行判定。若同时存在上述特征峰且信噪比大于3，则检测结果判定为阳性。阴性结果代表该样品中不含有孔雀石绿或浓度低于5.0μg/kg。每批样品应同时进行空白实验和加标样品对照质控实验，且空白试样测定结果应为阴性，加标试样测定结果应为阳性。8.5复检和确证本方法为初筛方法，若初检结果为阳性，需要按照8.1和8.2步骤重新检测；重复检测结果仍为阳性，需要采用参比方法确证。参比标准为GB/T20361-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》。当结果判定为阳性时，以参比标准方法确证结果为最终报告值。9方法的灵敏度和准确性验证4T/LTIA25—20249.1灵敏度该方法中孔雀石绿残留物的检出限为5.0μg/kg。9.2准确性验证在相同条件下进行至少三次连续的独立测定，结果为一致。10检测报告检测报告应包含以下数据:——鉴定样品所需的所有信息；——对本文件的引用；——本文件中未指定或视为可选的任何操作细节，以及可能影响测试结果的任何事件的细节；——测试日期；——测试结果。5T/LTIA25—2024孔雀