DB45T 2804-2023 猕猴桃细菌性溃疡病PCR诊断技术规程

45DB45/T2804—2023猕猴桃细菌性溃疡病PCR诊断技术规程Technicalcodeondiagnosisofbacterialcankerdiseaseofkiwifruitby2023-12-26发布2024-02-01实施广西壮族自治区市场监督管理局发布I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结1本文件确立了猕猴桃细菌性溃疡病PCR诊断技术的程序，给出了缩略语、诊断原理，规定了样品采本文件适用于广西壮族自治区行政区域内猕猴桃属植物感染猕猴桃细菌性溃疡2规范性引用文件猕猴桃细菌性溃疡病bacterialcankerdiseaseofkiwifrubp：碱基对DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）PCR：聚合酶链式反应（PolymerTaq酶：TaqDNA聚合酶（Taqenzyme）pH：氢离子浓度指数（Hydrogenionconcentrati利用猕猴桃细菌性溃疡病菌DNA特异性扩增引物，在热稳定DNA聚合酶的作用下，合成大量目标DNA片段，最终通过凝胶电泳分离检测出特定大小的猕猴桃细菌性溃疡病菌特异性DNA谱带，根据该谱带的26.1.1采有典型和疑似症状的植株叶片样品（参见1234567PCR缓冲液[×10，含15mMMg2+]89DNA分子量标准（DNAmaker，可区分100bp～31PCR扩增仪23456789PCR反应管采集的样品经处理后，在2℃~8℃条件下保存应不超过2周，若需长期保存，应置于-70采用商用植物基因组DNA提取试剂盒（推荐使用按照其操作步骤和方法提取样品总DNA，或者选用其他能达到PCR扩增质量要求的方法提取样品总DNA，4），束后，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统中拍照保存，正向引物5’-CAGAGGCGCTAACGAGG1-2PCR缓冲液[×10]11-按表3，依次向PCR反应管中加入超纯水、dNTPs、PCR缓检测时设置空白对照、阳性对照（猕猴桃细菌性溃疡病菌基因组DNA）和阴性对照（健康猕猴桃植分子量作为片段大小的标准，在120V电压下电泳约60min。5电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统中拍照保存8诊断后样品处理DNA提取液放置于-20℃以下，以备复检。用于猕猴桃细菌性溃疡病菌检测的植物样品、用具，以6DB45/T2804—2023(资料性)猕猴桃细菌性溃疡病症状特征A.1叶片症状特征叶片发病时在新生叶片上呈现褪绿小点，水浸状，后发展为1mm~3mm的不规则形或多角形褐色病斑，边缘有明显的淡黄色晕圈。高温条件下病斑呈红色，在连续阴雨低温条件下，病斑扩展很快，有时也不产生黄色晕圈。叶片上产生的许多小病斑相互融合形成枯斑，叶片边沿向上翻卷，不易脱落。秋季叶片病斑呈暗紫色或暗褐色，容易脱落。症状特征见图A.1。图A.1叶片症状特征A.2枝干症状特征感病植株最初从发病部位芽眼、叶痕、皮孔、小伤口等处溢出乳白色粘质菌脓，划破皮层可见韧皮部开始变为深灰色腐烂。病部皮层组织逐渐变软呈水浸状下陷，树干或大枝上可出现纵向裂缝。植株进入伤流期后，病部的菌脓与伤流液混合从伤口漫溢出，呈锈红色。病斑扩展绕茎一周后导致发病部以上的枝干坏死，也会向下部扩展导致地上部分枯死或整株死亡。症状特征见图A.2。图A.2枝干症状特征7定容至1000mL，调节pH为8.0，高温灭菌），8