发酵工艺控制2

第三节

pH值对发酵过程的影响及控制

发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数。它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。一.pH值对发酵过程的影响1.对微生物生长和生物合成的影响每一类菌有其最适的和能耐受的PH范围。大多数细菌PH为6.3-7.5,霉菌和酵母菌生长最适PH为3-6,放线菌生长最适PH为7-8。微生物生长阶段和产物合成阶段的最适PH往往不一致这不仅与菌种特性有关，也取决于产物的化学性质如霉菌类，由产黄青霉菌产生的弱酸性青霉素，其合成的最适PH为6.5-6.8，而由黑曲霉产生的柠檬酸，其合成的最适PH为3.5-4.0。

2.发酵过程中pH的变化

发酵过程中由于菌在一定温度及通气条件下对培养基中碳、氮源等的利用，随着有机酸或氨基氮的积累，会使pH产生一定的变化。一般情况下：（1）生长阶段

pH上升：菌体蛋白酶分解蛋白胨而生成铵离子

pH下降：葡萄糖分解产生的有机酸及铵离子利用（2）生产阶段

在生产阶段，pH趋于稳定，维持在最适产物合成的范围（3）自溶阶段菌丝自溶阶段，随着基质的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH又上升，此时菌丝趋于自溶而代谢活动终止引起发酵液中pH下降的因素有：培养基中碳、氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累而PH下跌。消沫油加得过多。生理酸性物质（如：糖类氧化不完全时产生有机酸、脂肪不完全氧化后产生的脂肪酸）的存在，氨盐被氧化，PH下降。引起发酵液中pH上升的因素有：

培养基中碳、氮比例不当，氮源过多，氨基氮释放，使pH上升。生理碱性物质（有机氮源、硝酸盐、有机酸等）存在。中间补料中氨水或尿素等的碱性物质的加入过多。

PH的变化会引起各种酶活力的改变，影响菌对基质的利用速度和细胞的结构，以致影响菌体的生长和产物的合成.pH值还会影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜的渗透性的变化，因而影响菌对营养的吸收和代谢产物的形成等。此外它还影响某些产物合成的方向。因此，确定发酵过程中的最佳pH值及采取有效控制措施是保证或提高产量的重要环节。二.最适PH值的选择最适PH值的选择原则是既有利于菌体的生长繁殖，又可以最大限度地获得高的产量。一般都是根据实验结果来确定的。方法：通常将发酵培养基调节成不同的起始PH值，在发酵过程中定时测定、并不断调节PH，以维持其起始PH值，或者利用缓冲剂来维持发酵液的PH值。同时不断的观察菌体的生长情况，菌体生长达到最大值的PH值即为菌体生长的最适PH。产物形成的最适PH也可以这样测得。三.pH值的控制首先要在基础培养基配方中考虑到维持pH的需要，然后通过中间补料来控制pH

培养基碳过多：pH下降培养基氮过多：pH上升2通过补加氨水、尿素或硫酸铵、碳酸钙来调节pH在发酵工业生产上如何保证发酵中氧的供给，以满足生产菌对氧需求，使氧的供、需这一对矛盾不成为发酵生产时限制因素是稳定和提高生产、降低成本的关键之一。如何利用溶氧参数来指导发酵生产是溶氧监控技术能否推广的关键。第四节溶解氧对发酵的影响及控制一.溶解氧作为考察发酵中氧是否足够的度量，了解菌对氧利用的规律。为什么发酵中氧容易变为主要矛盾呢?

氧是一种难溶于水的气体，在25℃，大气压下，氧在纯水中的溶解度仅为1.26mmol/L，空气中的氧在纯水中的溶解度更低，培养基因含有大量的有机无机物质，氧的溶解度比水中还要更低。而随着高产菌株的广泛应用和丰富培养基的采用，对氧气的需求更大，即使培养基是被空气饱和的，它所储存的氧量很少，在发酵旺盛期一般只能维持正常呼吸15-60秒，其后，微生物的呼吸就会受到抑制，所以大多数微生物深层培养需要适当的通气条件，才可以维持一定的生产水平。好气性微生物深层培养时需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些代谢产物的合成。对多数发酵来说，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。

临界氧浓度一般指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。如对产物形成而言便称为产物合成的临界氧浓度。

通过在各批发酵中维持不同氧浓度看其对摄氧率或产量的影响，可以求出菌呼吸或合成的临界氧浓度

卷须霉素三批发酵的氧浓度与摄氧率，可见其临界氧浓度在13%-23%饱和度之间

影响抗生素合成的临界氧浓度不一定与影响呼吸的临界氧浓度一样。头孢菌素C发酵的呼吸临界氧浓度为7％，而其生物合成的最低允许氧浓度比前者大，为10％一20％。对卷须须霉素来说，呼吸临界氧浓度为13％一23％，而合成所需要的最低允许氧浓度比前者小，为8％左右。

生物合成最适氧浓度与临界氧浓度是不同的，前者是指溶氧浓度对生物合成有一最适范围。低了固然不好，但过高对产量也未必都有利。对卷须霉素来说，发酵12－70小时之间维持在10％，氧浓度显然比在45％氧浓度或0％氧浓度的产量要高由此可见，为了避免使抗生素的合成处在限制氧的条件下，需要考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度，并使发酵过程中保持在最适氧浓度。这样便有可能减少批与批之间的波动和更有效地利用空气动力。在正常的发酵的工艺的情况下，溶氧变化有一定的规律

在一批发酵中的不同阶段，需氧和供氧情况都在变化，若菌需氧量大于供氧能力，此时培养液中的溶氧值就会下降。在前期生长阶段常有一溶氧低谷是多数发酵的规律，但低谷到来的迟早和低谷时的溶氧水平随工艺、设备条件而有不同，同一品种在供氧较充裕条件下，低谷时的溶氧水平较高，反之，溶氧水平较低。在溶氧低谷阶段，加强供氧对发酵单位是否有好处目前还没有足够的数据加以判断。但若低谷时的溶氧水平低于临界值，改善供氧状况会有益。在产物合成阶段，同一种发酵有一定的规律，这种规律会受到工艺控制改变的显著影响。如补料、加糖、加油、通氨的数量、加入时机和方式对溶氧水平均有一定影响。一般一次补料过多会再次出现溶氧低谷，前期耗氧比中后期大。到后期因停止补料，溶氧就会逐渐升高。二.溶解氧作为发酵异常情况的指标1.发酵中污染好气性杂菌－发酵2～3小时时溶解氧迅速下降跌零后长时间不回升

这比无菌试验预报几乎提前4—5个小时。但不是一染杂菌溶氧就掉到零，要看杂菌的种类和数量。在灌内与生产菌比，谁占优势。有时会出现染菌后溶氧反而升高的现象，这是因为生产菌受到杂菌的抑制。而杂菌本身又非十分好气。这样生产菌的呼吸大为减弱而使溶氧上升。另外补料或加油在供氧不良的灌内也会引起溶氧迅速降低，若溶氧原来较低就容易降至零，一般1—3小时溶氧即回升，这可与染菌时的溶氧变化相区别。2污染噬菌体－菌液变稀，溶氧回升3工艺错误赤霉素发酵时有的罐批会出现发酸现象，遇到发酸时氨基氮迅速上升，溶氧会很快升高，发酸可能是溶氧不足而引起的。导致溶氧处于较低水平的原因是工艺控制不善，如补料间隔过密或补料量一次较多均会引起上述情况，如图所示。。4操作故障

有的也能从溶氧变化中得到反映。例如，停搅拌后未能及时开动或搅拌发生故障、空气未能与液体充分接触等均会使溶氧比通常所处水平低得多。又如一次加油过多也会使溶氧水平显著降低。5.作为质量控制指标

在天门冬酰氨酶发酵中，前期是好气培养而后期转为厌气培养，酶的活力可大为提高。而掌握由好气转为厌气培养的时机是颇为关键的；经试验发现当溶氧值下降到45％饱和度时，就从好气培养转为厌气培养，并适当地补充基质，培养液中天门冬酰氨酶的活力提高六倍。三.溶氧作为发酵中间控制的手段之一国外有的厂已成功地将溶氧或排气二氧化碳与pH值一起作为控制青霉素发酵的参数。原理：在发酵过程中添加糖时，菌丝量和呼吸会因此增加，摄氧率增加多少取决于所补糖的质和量，补糖后从记录中可看出溶氧明显下降的趋势。相反，培养液中可利用的碳源的减少，便导致呼吸的减少，溶氧上升，故利用上述现象便可有效控制溶氧在所需的最适范围内。补料方法：经验告诉我们补糖控制最好是少量多次或流加。

原因：如果通气效果较差，如空气搅拌罐，一次加糖过多，将导致氧的需要总量超过设计灌所能提供的最大供氧速率，培养液中的溶氧便容易跌到零，以使处于生物合成临界氧值以下。据报导，青霉素发酵的临界氧值在5％一10％之间。低于此值会使青霉素的合成带来不可逆的损失，时间越长，损失越大，故如何恰当地控制补料或加糖使矛盾不要转化为氧的不足方面是值得研究的。控制原则：应当是葡萄糖加入的速度正好在生产菌处于所谓“半饥饿状态”。使其仅能维持正常的生长代谢，即把更多的糖用于抗生素的合成。并永远不超过罐设计时的灌所能提供的最大供氧速率“水平。

四.溶氧作为考查设备、工艺条件对氧供需与产物形成影响指标之一在生产中发现溶氧水平较低，处于临界氧值以下时，为了提高发酵液中的溶氧水平不外从两方面着手：一方面提高设备的供氧能力。考虑改变设备条件以提高供氧系数是积极的方面

如搅拌器类型和叶片形状另一方面可以从需氧方面考虑。有效地利用现有的设备条件就需要适当地控制菌对氧的消耗，使之既能充分利用现有的供氧条件又不致于生长过盛而陷于缺氧的处境，事实上工艺方面有许多行之有效的措施，如控制补料速度、温度的调节、液化培养基，中间补水、添加表面活性剂等均与溶氧的改善或维持合适的溶氧水平有关。五.溶解氧浓度的控制

培养液中氧浓度的任何变化都是供需平衡的结果。调节发酵液中溶氧含量不外从供、需两个方面去考虑。A供氧方面，凡能使在灌内氧分压下培养液中氧的饱和浓度和传质系数增加的方法，均能使发酵液的供氧改善。可通过下列办法：(1)在通入的空气中掺入纯氧，使氧分压增高(2)提高灌压，这种方法固然能增加氧的饱和度，但同时会增加二氧化碳的溶解度，影响PH及可能会影响菌的代谢。另外还会增加对设备的强度要求。(3)改变通气速率其作用是增加液体中夹持气体体积的平均成分。但在常速搅拌下增加通气速率以提高氧的传递速率是一种递减性的，即当气流速度越大，再增加其速度对氧的溶解度的提高作用越小。并且当系统被气流引起液泛时，传质速率会显著下降，使泡沫增多，罐的有效利用率减小。故还是采用控制搅拌效果较佳。总之增加搅拌的重要作用在于改善灌内液体的混合和循环，从而具有抑制气泡聚合的效果。并且液相的良好混合可避免低于平均氧浓度的“死角”的存在。B需氧方面(1)养料的丰富程度影响菌的生长。通过减少菌的生长速率也可达到限制菌对氧的大量消耗从而提高溶氧水平。(2)温度的影响由于氧传质的温度系数比生长速率的温度系数低，降低培养温度可得到较高的溶氧值。但采用降低温度使偏离最适的产物生物合成的温度以来得较高的溶氧值是不值得的。大规模生产中采用控制气体成分的方法是既费事又不合算，因氧的成本高。但在紧要关头，也就是菌体的摄氧率，达到最大时，可用富氧的方法提高气体中氧的含量，从而改善供氧状况。一般来说，高氧需求的时间是相当短的。因此这一方法总的来说是较为便宜可靠的。

溶氧浓度只是发酵参数之一，它对发酵过程的影响还必须与其他参数配合起来分析。如搅拌的程度对菌的呼吸和溶氧浓度有较大的影响，但分析时要考虑到其他因素，如菌丝形态、泡沫的形成，二氧化碳的排除等的作用。第五节其它因素对发酵的影响及控制一.二氧化碳对发酵的影响及控制1.二氧化碳的来源及对发酵的影响

CO2是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢的一种基质，它是细胞代谢的重要指示。溶解在发酵液中的CO2对氨基酸、抗生素等微生物发酵具有刺激或抑制作用。

CO2对生长具有直接的影响。例如，环状芽孢杆菌等已经发芽的孢子在开始生长的时候，对CO2有特殊需要。CO2是大肠杆菌和链霉菌突变株的生长因子，菌体有时需要含30％CO2的气体才能生长。这种现象被称为CO2效应。通常CO2

对菌体生长具有抑制作用．当排气中CO2的浓度高于4％时，微生物的糖代谢和呼吸速率下降。CO2对微生物生长的影响CO2对微生物发酵也有影响

如牛链球菌发酵生产多糖，最重要的发酵条件是提供的空气中要含有5％的CO2。精氨酸发酵也需要一定量的CO2

，才能获得最大产量，通常的最适分压约为0.12×105Pa，或高或低产量都会下降。CO2对某些发酵还能产生抑制作用，如对肌苷、异亮氨酸、组氨酸、抗生素等的发酵，特别是抗生素发酵中。对红霉素合成也有明显抑制作用，若在发酵15h后，按通气量的11％加入CO2

，对产生菌生长无不良影响、但红霉素产量减少60％。在四环素发酵中，需要控制一个最佳的CO2分压，才能获得最高产量。CO2会影响菌体的形态：

例,产黄青霉菌：当CO2分压为0~8%，菌丝主要呈丝状；

当CO2分压为15~22%，菌丝主要呈膨胀、粗短状当CO2分压为0.08×105时，则出现球状或酵母状，致使青霉素合成受阻CO2影响发酵的机理

CO2及HCO3-主要是影响细胞膜的结构，进而影响菌体生长、形态及产物合成它们分别作用于细胞膜的不同位点:溶解于培养液中的CO2主要作用在细胞膜的脂肪酸核心部位;而HCO3-则影响磷脂、细胞膜表面上的蛋白质。当细胞膜的脂质相中CO2浓度达一临界值时，使膜的流动性及细胞膜表面电荷密度发生变化，这将导致许多基质的膜运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，细胞生长受到抑制，形态发生了改变。影响发酵液的酸碱平衡，使发酵液的PH值下降，或与其他化学物质发生化学反应，或与生长必需金属离子形成碳酸盐沉淀，或氧的过分消耗引起溶氧浓度下降等原因，造成间接作用而影响菌体生长和产物合成。2.二氧化碳浓度的控制

CO2在发酵液中的浓度变化受细胞的呼吸强度、发酵液的流变学特性、通气搅拌程度、罐压大小、设备规模等的影响。由于CO2的溶解度比氧气大，所以随着发酵罐压力的增加，其含量比氧气增加的更快。大容量发酵罐的发酵液的按压力可达1×105Pa以上，再加上正压发酵，致使罐底部压强达1.5×105Pa。当CO2浓度增大时，若通气搅拌不改变，CO2不易排出。在罐底形成碳酸，使PH下降，进而影响微生物细胞的呼吸和产物合成。有时为了防止“逃液”而采用增加罐压消泡的方法，会增加CO2的溶解度，不利于细胞的生长。

对CO2浓度的控制主要看其对发酵的影响。如果对发酵有促进作用，应该提高其浓度；反之应设法降低CO2浓度。通过提高通气量和搅拌速率，在调节溶解氧的同时，还可以调节CO2的浓度，通气使溶解氧保持在临界值以上，CO2又可随着废气排出，使其维持在引起抑制作用的浓度之下。降低通气量和搅拌速率，有利于提高CO2在发酵液中的浓度。

CO2的产生与补料控制有密切关系。例如，在青霉素发酵中，补糖可增加排气中CO2的浓度，并降低培养液的pH值。

呼吸商与发酵的关系呼吸商：CO2释放速率与耗氧速率之比。

耗氧速率（

OUR）与CO2的释放率（

CER）成反向同步关系

呼吸商RQ=CER/OUR

RQ值反应菌体的的代谢情况,以酵母发酵为例:RQ=1,糖代谢走有氧分解途径，仅生成菌体，无产物形成

RQ>1.1,走EMP途径，生成乙醇

RQ=0.93,生成柠檬酸

RQ<0.7,生成的乙醇被当作基质利用

菌在利用不同基质时,RQ值不同：以大肠杆菌为例延胡索酸为基质,RQ=1.44

丙酮酸为基质,RQ=1.26

琥珀酸为基质,RQ=1.12

乳酸为基质,RQ=1.02

葡萄糖为基质,RQ=1.00

乙酸为基质,RQ=0.96

甘油为基质,RQ=0.80

在菌体生长、维持以及产物形成的不同阶段,其RQ值不同

二.基质浓度对补料发酵的影响及补料控制

１.基质浓度对发酵的影响

低基质浓度对代谢有诱导作用高基质浓度对分解代谢有阻遏作用

在葡萄糖浓度低于100~150g/L时,不会出现生长的抑制；但超过350~500g/L时,多数生物不能生长,这种浓度下会使细胞脱水。只有嗜渗性的生物能在这样高浓度的溶液中生长。基质浓度对发酵产物收率的影响

２.补料控制

为解除基质过浓的抑制、产物的反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应，以及避免在分批发酵中因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多而供氧不足的状况，采用中间补料的培养方法是较为有效的。

补料方式：连续流加、变速流加单组分补料、多组分补料三.泡沫控制一）泡沫的产生及其影响原因:通气和搅拌空气进人发酵液后，为了增加氧溶解速度，可以通过搅拌使大气泡变为小气泡，以增加气体与液体的接触面积，导致氧传递速率增加，这样也有利于二氧化碳气体的逸出。为了达到充分的气体交换目的，气泡应该在发酵液中有一定的滞留时间。所以在通气搅拌下产生一定数量的小气泡是增加氧溶解速度的必要手段。但是过多的泡沫就对发酵不利了。微生物细胞生长代谢和呼吸排出气体

如氨气、二氧化碳等，这些气体使发酵液产生的气泡也称为发酵性泡沫。培养基物理化学性质

培养基中的花生饼粉、玉米浆、皂苷、黄豆饼粉、糖蜜等中所含的蛋白质，以及微生物菌体等具有稳定泡沫的作用。许多起泡物质是表面活性物质，这些物质能降低发酵液的表面张力，而使发酵液容易起泡。此外液体的黏度越大，气泡液膜的黏度也大，泡沫也较稳定.

2.泡沫对发酵的影响A积极影响：

可以增加气液接触面积，导致氧传递速率增加。

B泡沫在发酵中的副作用:降低了发酵罐的装料系数，大多数罐的装料系数为0.6~0.7增加了细菌的非均一性由于泡沫液位的变动，以及不同生长周期微生物随泡沫漂浮，或粘在罐壁，使附着的菌体改变了环境，有的分化有的瓦解影响了菌群的整体效果。增加了污染杂菌的机会培养基随泡沫溅到轴封处容易染菌。导致产物的损失

大量起泡引起“逃液”，如降低通气量或加入消泡剂将干扰工艺过程。消泡剂的加入会使下游工程的分离带来困难3.工业发酵中泡沫的消长规律发酵过程中，培养液的性质随微生物的代谢活动而不断变化影响了泡沫的消长。发酵初期泡沫的稳定性高高表观粘度和低表面张力中期泡沫减少

随着霉菌产生的蛋白酶、淀粉酶的增多对碳、氮源的利用，造成泡沫稳定的蛋白质分解，培养液粘度降低促进表面张力上升，泡沫减少。另外菌体也有稳定泡沫的作用在发酵后期泡沫上升菌体自溶可溶性蛋白质浓度增加二）泡沫的控制了解了发酵过程中产生泡沫的原因及其消长规律，即可有效地控制泡沫，以不致于造成“逃液”对发酵不利的状况。泡抹控制的方法：机械消沫和消沫剂消沫微生物本身的特性着手，防止泡沫的形成。如单细胞蛋白生产中，筛选在生长期不产生泡沫的微生物突变株。利用几种微生物混合培养。A机械消泡原理：机械消沫是依靠物理学的原理，即靠机械力引起强烈振动或者压力变化促使泡沫破裂。罐内消泡:离心力罐外消泡:通过喷嘴的加速作用或离心力优点：不需要引进外界物质，可减少培养液性质复杂化的程度，也可节省原材料，减少污染机会。缺点:不能彻底消除泡沫B消泡剂消泡

消沫机理：降低液膜机械强度及表面粘度当泡沫的表层存在着由极