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DB45水牛胚胎冷冻保存技术操作规程Manipulationregulationforcryopreservationofem广西壮族自治区市场监督管理局发布I II 1 1 1 2 2 3 3 4 4 6 8 9II1水牛胚胎冷冻保存技术操作规程3.1超低温保存cryopreservation3.23.3水牛胚胎体外生产技术invitr3.4体外受精invitrofertilization,IVF23.5胞浆内单精子注射技术intracytopl3.6体细胞核移植somaticcellnucleartransfer,SCNT4.1试剂4.2耗材4.3设备4.4实验室要求5.1各胚胎发育阶段和质量等级的标记5.2不同种类胚胎的标记5.3胚胎细管标记5.3.1细管上标记的胚胎信息含冷冻时间、胚胎种类、胚胎个数、发育阶段、质量。具体标记见如下3A101。而如果是当天冷冻两枚A级体细胞核移植扩张胚胎，其细胞供体牛的序号为4001,则标记为5.3.2同时做好详尽的胚胎冷冻表格，注明胚胎所有的相关信息，胚胎信息登记表见附录C。6冷冻载体的准备6.1程序化细管的准备程序化冷冻细管材料应无毒、耐低温，细管规格以0.25mL为宜，细管外观正常、无变形、无裂痕，封口严密。6.2玻璃化冷冻载体的准备可以采用商业化的玻璃化冷冻载体；也可以采用0.25mL细管，用刀片将其一端斜切，形成一截斜切面，以此切面作为玻璃化冷冻的载体，如图1所示。图1玻璃化冷冻载体7胚胎的冷冻7.1胚胎的程序化冷冻7.1.1胚胎的洗涤7.1.2胚胎的平衡程序化胚胎冷冻液成分见附录B。将洗涤后的胚胎放入冷冻液中，室温下平衡15min~20min。7.1.3胚胎的装管将平衡后的胚胎装入0.25mL细管中，装管顺序为：冷冻液(2cm~3cm)→气泡(0.2cm~0.5cm)口。每支细管可装1～2枚发育状况与供体相同的胚胎，如图2所示。棉塞冷冻液气泡棉塞冷冻液气泡冷冻液和胚胎气泡冷冻液封口图2胚胎的装管顺序47.1.4冷冻程序率降至-7℃,用镊子缠好灭菌棉，浸入液氮，迅速接触细管棉塞和冷冻液的交界面进行植冰。植冰后7.2胚胎的玻璃化冷冻7.2.1液氮的准备7.2.2冷冻平衡液和冷冻液的准备7.2.3冷冻胚胎的平衡7.2.4玻璃化冷冻步骤8.1贮存冻胚和液氮的生物容器均不可叠放。用液氮生物容器贮存时，细管应完全浸没到液氮中。液8.2移动液氮生物容器时，应轻拿轻放，防止冲撞、震动和倾倒。9.1程序化冷冻胚胎的解冻9.1.1解冻液的准备9.1.2细管的解冻59.2玻璃化冷冻胚胎的解冻将带有胚胎的一端放入微滴内轻轻晃动，在体视显微镜下见胚胎脱出后，将胚胎取出用解冻9.3胚胎的复苏检测6A.1.1试剂名称A.1.2试剂要求A.1.3胚胎体外培养液3A.1.4血清的灭活处理）：）

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