《干血斑中9种维生素的测定高效液相色谱-串联质谱法》

团体标准

T/CAGRXXX-XXXX

干血斑中9种维生素的测定

高效液相色谱-串联质谱法

determinationof9vitaminsindrieddloodspotusinghighperformanceliquidchromatographytandem

massspectrometry

（征求意见稿）

XXX-XX-XX发布XXX-XX-XX实施

中国老年保健医学研究会发布

I

GB/XXXX—XXXX

干血斑中9种维生素的测定高效液相色谱-质谱法

1范围

本标准规定了用高效液相色谱-质谱法测定干血斑中9种维生素（维生素

B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B9、维生素A、维生

素D、维生素E）含量的方法。

本标准适用于干血斑中9种维生素含量的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅

所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包

括所有的修改单）适用于本文件。

BJS201716保健食品中9种水溶性维生素的测定

3原理

试样经手工或仪器提取后，采用液相色谱-串联质谱仪检测，内标法校正，

同位素外标法定量。

4试剂和材料

4.1试剂：甲醇（质谱级）。

4.2甲酸（质谱级）。

4.3七氟丁酸（质谱级）。

4.4乙腈（质谱级）。

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4.5异丙醇（质谱级）。

4.6PBS（pH=7.4）。

4.7牛血清白蛋白（色谱分离，适用于细胞培养）。

4.8维生素标准品

各种维生素及对应内标的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、

相对分子量见下表。

相对分对应维

中文名称英文名称CAS登录号分子式

子量生素

硫胺素Thiamine67-03-8C12H18Cl2N4337.2

Thiamine-(4-m维生素

1313

硫胺素C同C4C8H17Cl

13

ethyl-C-thiaz1257525-77-1341.2B1

位素N4OS·HCl

13

ol-5-yl-C3)

hydrochloride

核黄素Riboflavin83-88-5C17H20N4O6376.4

Riboflavin-(dio维生素

1315

核黄素CN83-88-5C13*C4H20N2

xopyrimidine-13382B2

同位素(unlabled)*N2O6

15

C4,N2)

烟酰胺Nicotinamide98-92-0C6H6N2O122.1

维生素

烟酰胺d4同Nicotinamide-2

B3

347841-88-7C6H2D4N2O126.6

位素,4,5,6-d4

4

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Pantothenic

泛酸599-54-2C9H17NO5219.2

acid

维生素

Vitamin[HOCH2C(CB5

泛酸C13N15同

B5(di-β-alaninN/AH3)2CH(OH)484.5

位素

13151513

e-C6,N2)CONH(C

13

calciumsaltH2)2CO2]2·

吡哆醛Pyridoxal65-23-6C8H11NO3167.1

维生素

吡哆醛d3同Pyridoxal-(metC8H6D3NO3

1173023-49-8170.2B6

位素hyl-d3)

叶酸Folicacid59-30-3C19H19N7O6441.4

维生素

Folic

13151315

叶酸CN同59-30-3C5C14H19

acid-(glutamic447.4B9

位素(unlabeled)NN6O6

1315

acid-C5,N)

视黄醇Retinol68-26-8C20H30O286.5

维生素

视黄醇d5同all-trans-Retino

1185244-58-9C₂₀H₂₅D₅O291.48A

位素l-d5

25-羟基胆钙25-Hydroxyvit维生素

19356-17-3C27H44O2400.6

化醇aminD3D

5

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25-羟基胆钙25-Hydroxyvit

化醇d3同位aminD3N/AC27D3H41O2403.7

素(6,19,19-d3)

Alpha-tocopher

α-生育酚59-02-9C29H50O2430.7

ol维生素

α-Tocopherol

α-生育酚d6

E

(phenyl-5,7-di113892-08-3C29D6H44O2436.7

同位素

methyl-d6)

4.9除另外有规定外，所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682中一级水

的要求。

4.10萃取液A：取5mL10%的甲酸水溶液，用甲醇定容到50mL。

4.11萃取液B：量取350mL甲醇及150mL水配成7:3(v/v)甲醇水溶液。

4.12液相流动相A（0.1%甲酸0.05%七氟丁酸水溶液）：精密量取500μL甲

酸和250μL七氟丁酸至500mL容量瓶，用水定容。

4.13液相流动相B：乙腈。

4.14模拟空白血浆配制

取2g牛血清白蛋白（BSA）溶解于约80mLPBS中，移至100mL容量瓶中，

用PBS定容，配成2%BSA-PBS溶液作为模拟空白血浆，保存于-20℃冰箱备用。

4.15维生素对照品储备液的配制

硫胺素标准储备液：称取硫胺素标准品0.1g（精确至0.0001g），用0.1%

甲酸水溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。

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盐酸吡哆醛、烟酰胺、泛酸标准储备液：分别称取盐酸吡哆醛、烟酰胺

和泛酸标准品0.1g（精确至0.0001g），用水溶解并定容至100mL棕色容

量瓶中。

核黄素、叶酸标准储备液：称取核黄素、叶酸标准品0.1g（精确至0.0001

g），加入30mL氨水溶解，甲酸调节pH值至7.0后，用水转移并定容至100mL

棕色容量瓶中。

维生素A、D、E标准储备液：分别称取视黄醇、25-羟基胆钙化醇、α-

生育酚0.1g（精确至0.0001g），用甲醇溶解并定容至100mL棕色容量瓶中。

4.16维生素内标储备液及内标液的配制

4.16.1内标储备液

硫胺素内标标准储备液：称取硫胺素C13同位素标准品0.1g（精确至0.000

1g），用0.1%甲酸水溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。

吡哆醛、烟酰胺、泛酸内标标准储备液：分别称取吡哆醛、烟酰胺和泛

酸内标标准品0.1g（精确至0.0001g），用水溶解并定容至100mL棕色容量瓶

中。

核黄素、叶酸标准储备液：称取核黄素、叶酸内标标准品0.1g（精确至

0.0001g），加入30mL氨水溶解，甲酸调节pH值至7.0后，用水转移并定容至

100mL棕色容量瓶中。

维生素A、D、E内标标准储备液：分别称取视黄醇、25-羟基胆钙化醇、

α-生育酚内标标准品0.1g（精确至0.0001g），用甲醇溶解并定容至100mL

棕色容量瓶中。

4.16.2内标液

取“4.16.1”下制得的内标母液，用水混合定容到25mL制得如下表浓度的

维生素内标混合溶液A，保存于-20℃冰箱备用。

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将内标液A稀释5倍制得内标液B。

维生素B1内标25ng/mL

维生素B2内标100ng/mL

维生素B3内标1000ng/mL

维生素B5内标500ng/mL

维生素B6内标250ng/mL

维生素B9内标50ng/mL

维生素A内标1000ng/mL

维生素D内标150ng/mL

维生素E内标5μg/mL

4.17基质标准曲线的配制

取“4.15”项下维生素对照品母液，用模拟空白血浆稀释制得如下表浓度混

合基质标准曲线模拟血浆样本。

维生素B11、2、5、15、20、25ng/mL

维生素B22、5、10、20、40、80ng/mL

维生素B3200、500、1000、2000、4000、8000ng/mL

维生素B550、100、150、200、400、800ng/mL

维生素B65、10、20、40、60、80、100ng/mL

维生素B91、2、5、10、15、20ng/mL

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维生素A50、100、150、200、400、800ng/mL

维生素D5、10、20、40、80、120ng/mL

维生素E0.2、0.5、1、2、4、8μg/mL

5仪器和设备

5.1液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（LC-MS/MS）

5.2电子天平（感量0.01mg）

5.3干血斑全自动萃取仪

6测定步骤

6.1试样制备

用医用酒精棉签擦拭右手中指指尖采血部位，等酒精干燥。用微创采血

针压于指腹采血，轻柔按压手指创口朝下收集血液到血液收集管中，收集约

100μL血液，用移液枪移取指尖血20μL，滴于DBS卡印圈正中心。将干血斑

卡片放置于全自动干血斑萃取仪室温条件下（22-26℃）干燥3h后，转移至密

封铝箔袋中，置于-80℃冰箱中保存备用。

6.2样品前处理（手工或使用全自动萃取仪）

6.2.1向干血斑点均匀添加10μL内标液B（手工或使用全自动干血斑萃取

仪），干燥30s；使用20μLDBS萃取液对干血斑进行萃取，并将全部萃取液

B进样到LC-MS/MS（在使用手工萃取的情况下萃取液应经过0.22μm在线柱

前过滤器）。

6.3液相条件

6.3.1色谱柱：PhenomenexKinetex2.6μmPFP色谱柱（100×4.6mm）或同

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性能其他色谱柱

6.3.2流动相A为0.1%甲酸0.05%七氟丁酸水溶液，B为乙腈，总流速为

0.7mL/min。流动相梯度如下表：

时间（min）流动相B（%）时间（min）流动相B（%）

054.595

15895

3608.15

3.560105

6.3.3进样条件：柱温箱温度为40℃；从DBS进样，进样体积为20μL。

6.4参考质谱条件

6.4.1离子源参数：

离子源电喷雾电离正离子模式（ESIpositive）

扫描模式多反应监测（MRM）

气帘气(CUR)35Psi

碰撞气（CAD)Medium

雾化气（GS1）60Psi

辅助加热气（GS2）60Psi

温度（TEM）650℃

离子喷雾电压（IS）5500V

6.4.2质谱参数

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每个离子对扫描时间为20ms，EP均设置为10，CXP均设置为10，其余

参数设置如下图所示：

Q1mass

Q3mass（Da）DPCE

（Da）

定量离子12217

硫胺素26540

定性离子14414

硫胺素定量离子12223

C13同位26940

定性离子148.123

素

定量离子24334

核黄素37788

定性离子17252

核黄素定量离子24935

C13N1538390

定性离子17552

同位素

定量离子8024

烟酰胺123130

定性离子9622

烟酰胺定量离子8429

d4同位12790

定性离子10024

素

定量离子9019

泛酸22030

定性离子18421

泛酸定量离子9421

C13N1522440

定性离子18832

同位素

定量离子15015

吡哆醛16858

定性离子9432

吡哆醛定量离子15319

d3同位17165

定性离子9733

素

定量离子29522

叶酸44246

定性离子17653

叶酸定量离子29524

44860

C13N15定性离子34426

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同位素

定量离子9322

视黄醇26960

定性离子11925

视黄醇定量离子9321

d5同位274.250

定性离子12421

素

25-羟基定量离子25719

胆钙化383.3115

定性离子15934

醇

25-羟基定量离子257.419

胆钙化