DB37T 4415-2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术　　

37Detectionofβ-lactoglobulingeneknockoutcowandβ-lactoglobulinincow'smilkI本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定高亚平、刘文浩、王金鹏、杨春红、李彦芹、宋明智、1β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术本文件确立了β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶链式反应（P奶中β-乳球蛋白（BLG）的定性免疫印迹（Western-Blot本文件适用于β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中βGB/T6682分析实验室用水规格和GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T27642—2011牛个体及亲子鉴定微卫星DNNY/T1663—2008乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法NY/T1672—2008绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程NY/T2695—2015牛遗传缺陷基因检测技术规程SN/T2497.16—2010进出口危险化学品安全试验方法第16部分：Western-Bl农业部2031号公告-14-2013转基因动物及其产品成分检测普通牛(Bostaurus)内标准基因牛β-乳球蛋白基因Bostaurusβ-lactoglobulBLG基因（NCBIReferencesequence:NC_037338.1简称PAEP，来源于普通牛（Bostaurus4聚合酶链式反应（PCR）法-基因定性通过设计特异引物，扩增出包含牛BLG基因全长的DNA片段，对扩增产物进行测序分析。依据BLG基24.2试剂或材料4.3仪器设备4.3.1PCR扩增仪：温度范围4℃~99℃,温度梯度范围20℃,模块单元96×0.2mL。4.3.6高压灭菌锅：使用温度范围45℃~135℃4.3.7微波炉。4.4样品4.5试验步骤基因组DNA提取按照GB/T27642—2011DNA浓度和纯度检测按照NY/T1672—2008中7.3的规定执行。3按照NY/T2695—2015中6.44.5.5测序分析4.6结果判定与表述4.6.1对照检测结果分析4.6.2样品检测结果判定和表述5免疫印迹（Western-Blot）法-蛋白定性检测对预处理的牛奶样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用牛β-乳球蛋白特异性第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体进行检测，根据条带位置和着色5.2试剂或材料）：45.2.815%SDS分离胶（5mL）：1.1mL蒸馏水，2.5mL30%丙烯酰胺溶液，1.3mL1.5MTris-HCl(pH8.8)，0.05mL10%SDS，0.05mL10%过5.2.95%SDS浓缩胶（2mL）：1.4mL蒸馏水，0.33mL30%丙烯酰胺溶液，0.25mL1.0MTris-HCl(pH6.8)，0.02mL10%SDS，0.02mL10%过）：）：）：5.3仪器设备5.3.3高压灭菌锅：使用温度范围45℃~1355.3.4金属水浴锅：控温范围-10℃~100℃。5.4样品称取固态样品5g，加适量水溶解，定容至50mL，5.5试验步骤-乳球蛋白标准品，加入5×SDS加样缓冲液，100℃水浴10min。55.5.4转膜按照SN/T2497.16—2010中转5.5.5封闭在自封袋中加入适当比例稀释的兔抗牛β-乳球蛋白一抗抗体，放入PVDF膜，排净气泡后封口，室温水平摇动2h。5.5.7洗膜封口，室温水平摇动1h。5.5.9洗膜5.5.10显影5.6结果判定与表述β-乳球蛋白标准品检测到预期大小（18kD）的条带，空白和阴性对照无特异性条带，则表明量处出现和β-乳球蛋白标准品泳道中大小一致的条带，判定该样品含β-乳球蛋白，表述为“β-乳球在微孔板上预包被牛β-乳球蛋白抗体，样品中的β-乳球蛋白与生物素标记的β-乳球蛋白竞争性地和微孔中的抗体结合，然后加入亲和素-辣根过氧化物酶偶联物，加入显色底物，终止液终止反应，再乘以稀释倍数即可得出样品中β-乳球蛋66.3.3高压灭菌锅：使用温度范围45℃6.3.4恒温箱：温控范围为室温+5℃~80℃。按照5.4.1和5.4.2对样品进行脱脂处理，用稀释缓冲液将样品稀释1000倍（预测样品中β-乳球蛋6.5.1准备实验所需试剂，并平衡至室温（20℃~25℃)。76.6.3标准曲线上样品吸光度值对应的β-乳球蛋白浓度，乘以样品稀释倍数，即为所测样品中β-乳球蛋白含量。若检测的β-乳球蛋白浓度高于标准品最高浓度，对样品进行合适倍数稀释后再检测。计8gcctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactcctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAACGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGC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