仪器分析实验讲义2011.11

PAGEPAGE13目录实验一取代基电效应对芳烃吸收带的影响及导数光谱的测绘实验二紫外分光光度法测定苯甲酸钠的含量（标准曲线法）实验三柱色谱法测定氧化铝的活度实验四纸色谱法分离分析有机酸实验五薄层色谱法分离分析混合染料实验六高效液相色谱定性分析实验七气相色谱法定性分析实验八高效液相色谱法定量分析（外标法一点法）实验九固体样品红外透射光谱的测定实验十气相色谱法测定乙酸乙酯中苯的含量（内标两点法）实验一取代基电效应对芳烃吸收带的影响一、目的要求通过测定几种典型的发色基团取代苯和助色基团取代苯的E2吸收带及B吸收带，掌握取代基的共轭效应和诱导效应对吸收带波长影响的规律，及它们在结构分析中的应用。二、原理取代基对芳烃吸收带的影响与取代基结构、取代基个数、位置有关。研究取代基对芳烃吸收带的影响规律，对确定有机化合物结构具有重要的作用。对于发色团取代的苯，由于含有键的发色团(、、等)与苯相连时，共轭，产生更大的共轭体系，E2带(＞104)红移，在200～250nm范围出现；同时B吸收带也产生较大红移。若取代基是含有n电子的发色团，分子除了可以发生跃迁之外，还可能发生跃迁，谱图中还会出现低强度的R吸收带。对于助色团取代苯，由于含有未成键电子对的助色团(-OH,-OR,-NH2,-NR2，-X等)与苯相连时，产生共轭，使E2带、B带均红移；B带吸收强度增大，精细结构消失。三、仪器与试剂（1）仪器：紫外分光光度计。（2）试剂：浓度为5.0×10-3mol/L的苯/乙醇溶液；6.0×10-5mol/L的苯甲酸/乙醇溶液；5.0×10-4mol/L的苯胺/乙醇溶液；1mol/L的HCl/乙醇溶液；无水乙醇。四、实验步骤1．用1cm吸收池，以无水乙醇为参比，分别测定苯、苯甲酸、苯胺的乙醇溶液在波长200~340nm区域内的紫外吸收光谱。2．用1cm吸收池，以无水乙醇为参比，测定苯胺的紫外吸收光谱，在苯胺中加入1滴1mol/LHCl/乙醇溶液，再次测定紫外吸收光谱，进行比较。五、数据处理1．分别测定苯、苯甲酸的E2吸收带的、，同时观察B吸收带的位置，比较发色团对芳烃吸收带的影响。2．比较苯胺与苯胺盐B吸收带波长与强度的变化。3．根据取代基电效应对以上实验结果作出正确的解释。六、问题讨论1．对上述实验中所列的化合物，如果采用不同极性的溶剂进行测定，吸收带将会有什么变化？2．从苯胺及其盐的紫外吸收带的变化，给你什么启示？有何实际应用价值？实验二紫外分光光度法测定苯甲酸钠的含量（标准曲线法）一、目的1．掌握紫外分光光度计定量操作方法。2．掌握标准曲线法定量计算方法。二、提要标准曲线法定量分析，即用已知量的标准物质，配制一系列浓度的标准溶液，在相同的条件下进行测定，以仪器的响应值（UV-Vis法中为吸光度A）为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。利用此曲线或它的回归方程，可以计算样品溶液中该组分的含量。式中a与b分别为标准曲线的截距与斜率。苯甲酸钠的紫外吸收光谱在229nm处有最大吸收。制备系列浓度的苯甲酸钠标准溶液，以229nm为检测波长，测定其吸光度，计算回归方程；可测定苯甲酸钠样品溶液中苯甲酸钠的含量。三、仪器与试剂紫外分光光度计；苯甲酸钠/0.04MHCl储备液（100μg/ml）；0.04mol/LHCl水溶液；样品溶液三、方法1检测波长的选择以0.04mol/LHCl溶液为参比溶液，于紫外－可见分光光度计上测定苯甲酸钠标准溶液的吸收光谱（200~320nm），确定苯甲酸钠含量测定的测定波长（λ229nm）。2苯甲酸钠标准曲线的绘制配制浓度为2、4、6、8、10μg/ml苯甲酸钠/0.04MHCl溶液。以0.04mol/LHCl溶液为参比溶液，测定系列浓度的苯甲酸钠/0.04MHCl溶液在229nm处的吸光度，计算其回归方程。3测定以0.04mol/LHCl溶液为参比溶液，测定样品溶液的吸光度值(n=3)，根据回归方程计算样品溶液中苯甲酸钠的含量（，RSD%）。四、思考题1．制备标准曲线的目的是什么？2．为什么要用/0.04MHCl溶液为参比溶液进行测定？实验三柱色谱法测定氧化铝的活度一、目的熟悉用柱色谱测定氧化铝活度的方法；了解吸附柱层析的一般操作方法。二、提要1．氧化铝的吸附能力等级测定方法较常用的为Brockmann法，观察对多种偶氮染料的吸附情况衡量氧化铝的活度。所采用的染料按吸附性（极性）递增的排列顺序为：偶氮苯（1号）<对甲氧基偶氮苯（2号）<苏丹黄（3号）<苏丹红（4号）<对氨基偶氮苯（5号）<对羟基偶氮苯（6号）。2．根据上述染料的吸附情况，可将氧化铝的活度分为五级，吸附性能越小，活度级别越大。三、仪器与试剂（1）色谱柱（长10cm，内径1.5cm）1根；带橡皮套的玻璃棒1根；小漏斗1个；10ml量筒2个；精致棉及圆形滤纸若干；（2）六种染料溶液：偶氮苯、对甲氧基偶氮苯、苏丹红、对氨基偶氮苯、对羟基偶氮苯各20mg，分别溶于10ml纯的无水苯中，加入适量石油醚定容至50ml；（3）苯和石油醚混和液（1:4）；（4）氧化铝（活度待测）。活度级别染料位置=1\*ROMANI=2\*ROMANII=3\*ROMANIII=4\*ROMANIV=5\*ROMANV柱上层柱下层流出液21321432543654四、实验步骤1．色谱柱的制备准备1根洁净干燥的色谱管，于管底垫一层精制棉（不要太紧），垂直夹在滴定台上，然后称取8g待测氧化铝，通过一干燥小漏斗，仔细装入色谱管中，用一带橡皮套的玻璃棒轻轻地均匀地敲打至氧化铝至高度约5cm处，然后在其表面覆一层圆形滤纸。2．氧化铝活度的测定①量取1、2号染料溶液各5ml（预先混匀），加入色谱柱中，待溶液全部通过后，立即以苯和石油醚混和液（1:4）20ml淋洗色谱柱，控制流速为20~30滴/min。②观察和记录色谱柱中染料的颜色和位置，判断氧化铝的活度级别。五、注意事项1．用于配制染料溶液的石油醚及苯必须是无水的。2．精制棉用量要少，要平整，但不要塞得太紧，以免流速过慢。3．色谱柱必须具有均匀的紧密度，表面应力求水平，染料溶液应小心地加入，勿使氧化铝表面受到扰动。4．倒入染料时，注意先把活塞打开，以利于空气排出。5．流出液用小烧杯收集，倒入回收瓶中。6．整个实验必须无水操作。六、思考题1．根据各染料的结构，说明极性递增和递减的顺序。2．如果加入2号、3号染料，色谱管流出液为无色，柱下层为淡黄色，柱上层为橙黄色，此氧化铝为几级？注：定级所用的染料编号、名称、结构及其溶液颜色如下：1号偶氮苯淡黄色2号对甲氧基偶氮苯黄色3号苏丹黄橙色4号苏丹红紫红色5号对氨基偶氮苯黄色6号对羟基偶氮苯黄色实验四纸色谱法分离分析有机酸一、目的１．掌握纸色谱的操作方法。２．了解纸色谱法在分离鉴定方面的应用。二、提要酒石酸和羟乙酸由于结构上差异，可用纸色谱法分离鉴定。展开剂用正丁醇－醋酸－水（12:3:5），显色剂用0.04％溴酚蓝/乙醇溶液。三、仪器与试剂（1）色谱筒（高22cm，内径5.5cm）1只；培养皿（Ф12cm）；三角喷瓶1只；点样毛细管；色谱滤纸若干；电吹风1只；（2）有机酸：2％酒石酸、2％羟乙酸、混和酸（酒石酸、羟乙酸2％），均为乙醇溶液；显色剂：0.04％溴酚蓝的乙醇溶液。（3）展开剂：正丁醇－醋酸－水（12:3:5）四、操作步骤1．条形（1）点样：取色谱滤纸（3.5cm×15cm）一条，在距纸的一端2~3cm处，用铅笔画一横线作为起始线，距离起始线6cm处划一横线。在起始线分别点样（酒石酸、羟乙酸、混和酸），点间距离约为1.2cm。待干后，再点第二次，一般每个样点2次即可，点的直径约为0.2~0.3cm。（2）展开：在色谱筒中放入展开剂20ml，将点好的色谱纸悬空吊在密闭色谱筒的挂钩上，饱和10min。再小心将挂钩往下推动，直至点有样品的一端浸入展开剂中约0.5cm处，展开。待展距（展开剂前沿离起始线）6cm左右时取出（大约80min），立即用铅笔划下溶剂前沿，并用电吹风吹干，直至无酸味（可用热风吹5min左右）。（3）显色：在色谱纸上喷以显色剂―0.04％溴酚蓝的乙醇溶液，用铅笔标出斑点的位置，并记录斑点的颜色。（4）定性：分别测量Rf值，并进行对照。2．圆形（1）点样：剪一比培养皿直径大0.5cm的圆形色谱滤纸，在中心划一十字，在距十字中心1.0cm处分别做一标记，每一标记处点一种样品，一般点样2次（点样方法同上）。（2）展开：在培养皿内放入展开剂10ml，卷一纸芯插在圆形色谱滤纸中间（十字中心），并将纸芯垂直浸入展开剂中展开。待展开剂前沿离原点4~4.5cm时取出（大约50~60min），立即划下溶剂前沿，并用电吹风吹干，直至无酸味（可用热风吹5min左右）。（3）显色：同上。（4）定性：同上。五、注意事项1．色谱纸要平整，不得沾污，点样时可在下面垫一白纸。2．条形色谱纸要挂垂直；圆形色谱纸要放水平，纸芯要放垂直。3．显色前必须把整张色谱吹干，直到无酸味为止。4．铅笔、直尺自备。不准用钢笔或圆珠笔在色谱纸上做记号。六、思考题1．根据酒石酸和羟乙酸的结构，推测哪个Rf值大，哪个Rf值小，为什么？2．影响纸色谱Rf值的因素有哪些？3．显色前为什么一定要把色谱纸吹至无酸味？4．色谱筒和色谱纸为什么要用展开剂饱和？实验五薄层色谱法分离分析混合染料一、目的掌握薄层硬板的制备方法；熟悉薄层色谱一般操作；掌握薄层色谱定性方法。二、仪器与试剂（1）仪器：层析槽、玻璃板、毛细管、量筒、台秤；（2）硅胶G、羧甲基纤维素钠（CMC-Na0.5％）、苯；（3）3.0mg/ml对羟基偶氮苯=1\*GB3①，3.0mg/ml对氨基偶氮苯=2\*GB3②，2.0mg/ml二甲黄=3\*GB3③，1.5mg/ml苏丹Ⅲ=4\*GB3④；（4）混和染料=5\*GB3⑤。三、提要1．TLC一般操作样品溶剂显色剂纯制制板→→→点样→→→展开→→→检出→→→定量2．定性：比较组分的Rf、Rst及斑点的颜色。3．分离效率评价：计算相邻斑点的分离度。L:斑点与原点之间的距离W：斑点的直径4．定量：薄层扫描法四、方法1．制板：称取硅胶4g于研钵中，加CMC-Na溶液10ml，研磨成均匀的糊状，倒在清洁的玻璃板上，用玻棒使其分布开（留有一空白处便于拿取薄板），轻轻晃动或摇动玻板，使成一均匀平坦的薄层，放在水平面上凉干。薄层板的活化：在110℃2．点样：取薄层板，在距一端2.5cm处，用铅笔轻轻画出一条直线作为起始线，离起始线10cm处再画一直线作为前沿线，用毛细管分别吸取染料=1\*GB3①、=2\*GB3②、=3\*GB3③、=4\*GB3④及混和染料=5\*GB3⑤分别点样1~2下。3．展开：将层析槽边缘上一层凡士林，将上盖合上拉磨数次；加入10ml苯于层析槽中，将层析槽一端垫高，将玻璃支架放在低端，并将薄层放入槽内的玻璃支架上（注意：薄层板不能浸入苯中）饱和10min后，展开10cm，取出。4．检出（定位）：有色染料=1\*GB3①、=2\*GB3②、=3\*GB3③、=4\*GB3④在薄层板上的分离情况无需特殊处理就一目了然。分别计算它们的Rf值。以染料=3\*GB3③为参比物，分别计算=1\*GB3①、=2\*GB3②、=4\*GB3④染料的Rst值。鉴定混合染料的组成。五、注意事项：1．点样原点直径控制在2~3mm之间。2．展开时层析槽要放平坦。3．展开剂中含水量的多少影响分离，故用干燥的仪器。4．展开前，层析槽内先用蒸气饱和，组分的Rf值易于重现。5．苯有毒，使用时注意防止污染环境。实验六高效液相色谱定性分析一、目的1．掌握高效液相色谱仪的使用方法。2．掌握在反相高效液相色谱分离过程中，当流动相比例发生变化时，组分保留时间及分离度的变化。3．学会高效液相色谱的定性方法。二、提要本实验是采用反相高效液相色谱法对已知组成的样品进行分离。在反相色谱中，固定相的极性小于流动相，流动相中水的比例越大，流动相的洗脱强度越小；组分的极性越小，在色谱柱上的保留能力越强。三、实验条件1．高效液相色谱仪；2．C18反相键合硅胶填充柱（4.6mm×250mm,5µm）；3．流动相：甲醇－水。流速：1ml/min。4．检测器：紫外检测器，检测波长254nm；5．对照品溶液：萘的甲醇溶液；样品溶液：苯、甲苯、萘、蒽的甲醇溶液。四、操作步骤1．将高压泵启动，调节流速1.0ml/min，流动相组成为甲醇—水（95:5），平衡色谱柱约10分钟。2．吸取样品溶液，进样，记录色谱图，并打印出各色谱峰的保留时间。3．改变流动相比例为甲醇—水（85:15），平衡色谱柱约10分钟，取样品溶液，进样，记录色谱图。4．在相同色谱条件下，取萘的对照品溶液进样，通过保留时间对照，对混合样品中的色谱峰进行定性。5.分析实验结果，观察流动相的改变对各组分保留时间及分离度的影响。五、思考题1．利用高效液相色谱仪定性的方法有几种？分别在什么情况下适用？2.根据样品中各组分的性质（极性大小），分析各组分的出峰顺序，找出样品中各色谱峰的归属。2．本实验的色谱原理属于哪一类？实验七气相色谱法定性分析一、目的１．练习气相色谱仪的使用，了解气相色谱仪的基本结构。２．掌握柱温的变化对组分保留时间及分离度的影响。３．学会气相色谱定性分析，掌握通过已知物保留值对比进行定性分析的方法。二、提要气相色谱是一种强有力的分离手段，实际工作中，有时遇到的样品其成分大体上是已知的，这时得到的气相色谱图可以借助纯的标样加以对照，利用保留值进行定性，这样的定性鉴定是相当简单的。当干扰组分与待测组分tR接近时，可采用峰高增加法定性：首先将样品进样，测定待测组分的峰面积；然后在样品中加入对照品，在相同的色谱条件下进样分析，如果待测组分的峰面积增加，且峰型对称，则为同一个组分；如果待测组分峰面积增加，但峰变形（加宽），或出现新的色谱峰，则不是同一个组分。三、仪器与试剂（1）气相色谱仪（FID检测器）；（2）微量注射器（1µl）；（3）标样：甲苯；（4）样品：苯、甲苯、乙酸乙酯、乙腈混合样品。四、操作步骤１．设置实验条件：色谱柱：甲基交联硅烷柱(25m×0.32mm,0.52μm)；温度：柱温35℃、80℃，检测室250℃，气化室250℃；载气N2；流量：1.2ml/min；分流比1:90。2．设定柱温为150℃，待仪器稳定后，注射0.2μl混合样品，记录色谱图及各组分的保留3．设定柱温80℃，待仪器稳定后，分别注射0.2μl混合样品和甲苯标样，记录色谱图及各组分的保留时间；通过保留时间对照，对混合样品中的组分进行定性分析4．将不同温度各组分的保留时间列成表格，确定混合物中各峰为何物，并讨论柱温的改变对组分保留时间及分离度的影响。五、注意事项１．实验前，对色谱仪整个气路系统必须进行检漏。如有漏气点，应进行排除。２．微量注射器应小心使用，用力不可过猛，芯子不要折弯，也不要全部拉出套外。若有不清楚之处，应立即报告指导老师妥善处理，样品溶液中如有难挥发溶质，使用完毕立即用乙醇或丙酮多次清洗，以免芯子受污而卡死。六、思考题1．保留时间、调整保留时间和相对保留值如何定义？他们各自的特点和适用范围如何？2．根据色谱原理，试推测在实验中苯、甲苯、乙酸乙酯、乙腈出峰先后顺序。3．气相色谱法定性的原理是什么？实验八高效液相色谱法定量分析（外标一点法）一、目的练习高效液相色谱仪的使用。二、提要外标法可分为外标一点法、外标二点法及标准曲线法。当标准曲线截距为零时，可用外标一点法定量。在药物分析中，为了减小实验条件波动对分析结果的影响，采用随行外标一点法，即每次测定都平行测定对照品与样品溶液。三、仪器与试剂1．高效液相色谱仪；2．ODS柱（4.6mm×150mm，5µm）；3．甲醇（色谱纯）；纯净水；4．检测器：紫外检测器，检测波长254nm；色谱工作站。5．混合样品；6.萘对照品（40μg/ml）四、操作步骤1．色谱条件C18反相键合硅胶填充柱；流动相：甲醇：水（85：15）；检测波长：254nm；流速：1ml/min。2．平衡色谱柱，分别吸取对照品溶液与供试品溶液，进样20µl，测定萘的色谱峰面积，并计算混合溶液中萘的含量。五、思考题1．外标一点法主要误差来源是什么？2．紫外检测器的优缺点分别是什么？实验九固体样品红外透射光谱的测定一、目的掌握固体样品的常规制样方法。了解红外光谱仪的工作原理及一般操作使用。对测定物质的红外光谱图进行解析。二、提要不同的样品状态(固体、液体、气体及粘稠样品)需要相应的制样方法。制样方法的选择和制样技术的好坏直接影响谱带的频率、数目和强度。（1）液膜法：样品的沸点高于100℃可采用液膜法测定。黏稠的样品也采用液膜法。这种方法较简单，只要在两个盐片之间，滴加1~2滴未知样品，使之形成一层薄的液膜。（2）液池法：样品的沸点低于100℃可采用液池法。选择不同的垫片尺寸可调节液池的厚度，对强吸收的样品用溶剂稀释后再测定。（3）糊状法：需准确知道样品是否含－OH基团(避免KBr中水的影响)时采用糊状法。这种方法是将干燥的粉末研细，然后加入几滴悬浮剂在玛瑙研钵中研磨成均匀的糊状，涂在盐片上测定。常用的悬浮剂有石蜡油和氟化煤油。（4）压片法：粉末样品常用压片法。将研细的粉末分散在固体介质中，并用压片装置压成透明的薄片后测定。固体分散截至一般是金属氯化物(如KBr)，使用时要将其充分研细，颗粒直径最好小于2μm(因为中红外区的波长是从2.5μm开始的)。（5）薄膜法：对于熔点低，熔融时不发生分解、升华和其他化学变化的物质，可采用加热熔融的方法压制成薄膜后测定。三、仪器与试剂付利叶变换红外光谱仪；压片机、模具、样品架；玛瑙研钵、钢铲、镊子、红外灯；KBr(光谱纯或分析纯)、苯甲酸。四、实验内容与步骤取2~3mg苯甲